VitaminE脂质体纳米颗粒携带siRNA靶向抑制丙型肝炎病毒的实验研究

摘要

目的：
　　研究携带针对丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）的小干扰RNA(siRNA)的Vitamin E（VE）脂质体纳米颗粒靶向抑制HCV复制的作用。
　　方法：
　　1．分别构建持续复制表达 HCV亚基因组的细胞株和瞬时表达HCV core蛋白的细胞株，并分别通过蛋白印迹和免疫荧光技术对细胞模型进行鉴定。
　　2．设计干扰HCV复制子和干扰HCV core的siRNA，分别转染相应细胞，通过荧光定量 PCR和蛋白印迹技术测定相关蛋白的表达情况，以验证其干扰效果。
　　3．通过薄膜水化法制备纳米颗粒VE-DC，将VE-DC与cy3标记的小干扰片段(siRNA-cy3)以不同的摩尔比例进行孵育，处理 Huh7.5.1细胞后通过流式细胞技术检测不同组转染效率来筛选最佳包封率。应用激光粒度分析、透射电子显微镜、凝胶电泳、CCK8试验检测纳米颗粒VE-DC/siRNA粒径、Zeta电位、血清稳定性及毒性。
　　4．VE-DC/siRNA-cy3处理Huh7.5.1-HCV细胞，通过荧光显微镜检测 VE-DC/siRNAs的入胞情况。用特异性 VE-DC/siRNA分别处理Huh7.5.1-HCV、Huh7.5.1-Core，通过荧光定量PCR、蛋白印迹和免疫荧光等方法测定基因与蛋白水平的表达水平，验证其有效性。
　　5．用 DC/siRNA(siRNA-5' UTR)或者 VE-DC/siRNA(siRNA-5' UTR)处理由质粒pRL-PK与pGL3-5' UTR-luc共转染的Huh7.5.1细胞，采用多功能酶分析仪检测相对荧光素酶活性进一步验证对 HCV复制的抑制作用。
　　6．采用高压水动力法尾静脉注射质粒 p-Core-3FLAG至 BALB/c小鼠中，构建肝脏特异性表达HCV core蛋白的动物模型，通过蛋白印迹和免疫荧光验证肝脏HCV core的表达。在建好的动物模型中通过尾静脉注射纳米颗粒 VE-DC/siRNA（siRNA-core），验证其在体内的干扰能力及靶向性。
　　7．采用高压水动力法向BAL B/c小鼠注射pGL3-5' UTR-luc质粒，建立肝脏HCV5' UTR调控的荧光素酶表达的动物模型；尾静脉注射纳米颗粒 VE-DC/siRNA(siRNA-5' UTR)后，用活体成像技术检测荧光素酶的活性，来验证体内的抑制效果。
　　8．检测重要脏器的组织学变化，血液系统的变化，生化反应变化等指标，来检测分析VE-DC/siRNA可能对机体的副作用。
　　结果：
　　1.成功构建了Vitamin E、胆固醇和DOTAP合成的VE脂质体纳米颗粒，该 VE脂质体纳米颗粒 VE-DC/siRNA的粒度分布为125.5±9.0 nm，zeta电位39.1±4.8 mV，形态呈球形，分散均一，细胞毒性相对较小，较好的血清稳定性，且VE-DC/siRNA-cy3在1：1比例混合时转染效率最高。
　　2.成功建立 Huh7.5.1-HCV和 Huh7.5.1-Core细胞模型，VE-DC/siRNA处理Huh7.5.1-HCV和Huh7.5.1-Core细胞后可见胞内大量颗粒状荧光的聚集且目的蛋白（NS3、NS5A、HCV core）表达量显著降低。
　　3.成功构建肝脏特异性表达 HCV core蛋白的动物模型，VE-DC/siRNA-cy3对肝脏有较好的器官靶向性，并有效抑制HCV core的表达。
　　4.在小鼠体内，纳米颗粒VE-DC携带siRNAs抑制HCV5' UTR调控的荧光素酶的表达，荧光素酶活性明显降低。
　　5.该纳米颗粒对细胞和小鼠无明显毒副作用。
　　结论：
　　VE脂质体纳米颗粒携带siRNA可抑制HCV的复制。基于VE脂质体纳米颗粒为平台的RNA干扰技术在HCV基因治疗的临床应用方面提供新的思路，具有潜在的临床应用价值。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一章Vitamin E脂质体纳米颗粒的制备及理化性质的鉴定

1.材料与方法

2. 结果

3. 讨论

参考文献

第二章体外细胞模型验证Vitamin E纳米颗粒携带siRNA对HCV的抑制作用

1. 材料与方法

2.结果

3.讨论

参考文献

第三章 动物模型中验证Vitamin E脂质体纳米颗粒携带siRNA对HCV抑制的有效性

1. 材料与方法

2.结果

3.讨论

参考文献

全文总结

文献综述：纳米颗粒在感染疾病诊治领域的应用及研究进展

致谢

硕士期间发表的论文