低强度脉冲超声对大鼠牙本质损伤修复过程中钙离子转运相关蛋白表达的影响

摘要

牙本质损伤是常见牙齿病损表现;牙齿磨耗、外伤或龋齿时均可累及;可引起牙齿敏感、疼痛甚至牙髓炎及根尖周炎;给患者造成生理、心理及经济上的多重负担。 由于牙本质组织结构的多孔性;当牙本质损伤暴露后;各种有害刺激可通过牙本质小管向髓腔内传导;促使牙本质牙髓复合体产生自我防御反应;形成可有效隔绝或减弱外界刺激、保护牙髓组织的第三期牙本质。因此深入了解牙本质牙髓复合体形成第三期牙本质的防御修复机制对于临床牙齿保存具有重要研究意义。 低强度脉冲超声（Low intensity pulsed ultrasound;LIPUS）是一种物理治疗方法;因其良好的促进骨组织修复再生作用而被广泛用于医学研究及临床。研究发现这种频率及强度均较低、以脉冲形式辐照于组织的机械声波可促进细胞代谢及软、硬组织的重建;特别是在骨组织形成方面效果显著。鉴于牙齿硬组织与骨组织的结构相似性;近来有越来越多的学者将LIPUS应用于牙槽骨、牙骨质及牙本质等牙体硬组织的组织再生工程学研究。本课题组前期实验发现LIPUS可促进大鼠牙本质损伤后牙本质牙髓复合体上DMP1、DSPP等牙本质基质蛋白的表达;提示LIPUS辐照可能参与并促进了第三期牙本质形成初期基质沉积及矿化晶核形成过程;而第三期牙本质作为一种矿化程度较高的硬组织;其形成过程除了基质沉积外更重要的是后续的矿化成熟过程;但目前对于LIPUS是否能促进第三期牙本质的矿化成熟过程尚无文献报道。 因此;本实验利用 SD 大鼠建立牙本质损伤动物模型;以观察LIPUS 辐照对牙本质牙髓复合体的影响;并通过检测第三期牙本质矿化过程中的重要蛋白：L型钙离子通道蛋白Cav1.2、钠钙交换泵NCX1及辣椒素受体电位通道蛋白TRPV1等表达情况;研究LIPUS是否参与了牙本质的矿化过程;进一步探索其对于第三期牙本质形成的作用。 第一部分 大鼠牙本质损伤修复模型的建立及组织形态学观察 实验随机选择40只雄性SD大鼠;在所有大鼠右侧上颌第一磨牙咬合面预备一深约0.5mm窝洞;建立牙本质损伤动物模型。取其中20只对其右上第一磨牙咬合面予以LIPUS辐照（强度30mW/cm2;频率：1.5MHz;脉冲信号长度：200μs;重复率：1KHz;持续时间：20min/d）;纳入备洞+LIPUS组;将该组大鼠所有左上第一磨牙作为空白对照组;均不做特殊处理;剩余 20 只大鼠对所有左上第一磨牙咬合面予以LIPUS辐照;作为LIPUS组;对其所有备洞处理后的右上第一磨牙不另行处理;作为备洞组。分别在处理第 1、3、7、14 天后每组处死 5只大鼠;取上颌第一磨牙及其周围牙槽骨为组织标本;石蜡切片;H&E染色;光镜下观察牙本质及牙髓腔内组织形态学变化。实验发现与正常牙髓组织相比;牙本质损伤后第1、3天牙髓组织即出现明显的炎症反应;7天时炎症反应消退;成牙本质细胞样细胞及第三期牙本质形成;证实了牙齿具有自我修复能力;且这种作用可能与炎症反应相关。备洞+LIPUS组第三期牙本质形成较备洞组更明显;提示LIPUS可能促进牙本质损伤修复过程。而LIPUS辐照健康牙齿并未引起牙髓组织形态学变化;这可能说明LIPUS在一定程度上是一种较为安全的理疗手段。 第二部 LIPUS辐照对L型钙离子通道蛋白Cav1.2及钠钙交换泵NCX1表达的影响 本部分实验分组及处理与第一部分一致;组织标本石蜡切片;采用免疫组化技术及图像分析软件观察分析在第三期牙本质矿化过程中起主要作用的Cav1.2及NCX1在牙髓组织中的分布及动态表达变化。 免疫组化染色显示：两种蛋白在各组均有不同程度表达;其中cav1.2主要定位于成牙本质细胞突起;NCX1则定位于整个髓腔牙髓细胞细胞膜和细胞质。图像分析结果显示：Cav1.2在备洞组、备洞+LIPUS组各时间点表达量均较空白对照组健康牙齿蛋白表达量明显增加。与备洞组相比;备洞+LIPUS组在1天、3天时表达明显增加;但至7天及14天后差异无统计学意义。而NCX1蛋白表达量在备洞组1天及备洞+LIPUS组1天、3天时较空白对照组明显升高;其余时间点无明显差异。与备洞组相比;备洞+LIPUS组在1天及3天时表达量明显升高; 7天及14天后则无明显差异。此部分实验提示LIPUS在牙本质损伤修复早期可促进钙离子转运相关蛋白的表达;协同促进牙齿的自我修复过程。此外;实验发现LIPUS组Cav1.2表达明显增加;我们推测这可能和cav1.2的机械敏感性有关;但其具体原因有待进一步研究分析。 第三部分 LIPUS 辐照对辣椒素受体瞬时转导电位通道蛋白TRPV1表达的影响 鉴于LIPUS的机械效应;本部分实验选择性地检测在成牙本质细胞上广泛存在;具有机械敏感性的;非选择性阳离子通道蛋白：辣椒素受体瞬时转导电位通道蛋白TRPV1。实验分组及样本处理如前;采用免疫组化染色及图片分析软件观察分析蛋白定位及动态表达情况;进一步探索LIPUS的具体作用机制。 免疫组化染色显示：TRPV1在各组均有表达;主要定位于成牙本质细胞突起。图像分析结果显示：TRPV1表达量在备洞组、备洞+LIPUS组各时间点及在LIPUS组1天时均较空白对照组明显升高;其余时间点无明显差异。与备洞组相比;备洞+LIPUS组在1天、3天及7天蛋白表达量均明显升高;至14天时两组蛋白表达均基本降到空白对照组水平;无明显统计学差异。此部分实验说明LIPUS辐照可能通过机械刺激激活TRPV1;促进牙本质牙髓复合体上TRPV1的蛋白表达;从而参与并促进第三期牙本质的形成。但这种调节作用表现出一定的时限性;具体机制仍需要进一步研究。 综上所述;本实验通过建立牙本质损伤修复的大鼠模型;研究LIPUS 对牙本质牙髓复合体的组织形态学影响及对第三期牙本质形成过程中钙离子转运相关蛋白表达的调控。研究发现LIPUS可能参与调节牙本质损伤后髓腔内的炎症反应;诱导成牙本质细胞样细胞形成;并上调损伤早期钙离子转运蛋白表达;加快第三期牙本质的形成过程。

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