SDF-1/CXCR4轴对感染VEGF的内皮祖细胞、血管平滑肌细胞的影响

摘要

目的 探索感染血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor;VE GF）的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells;EPCs)的生物学特性;探索基质细胞衍生因子1α(Stromalcell-derived factor 1α;SDF-1α)/趋化因子受体4(Chemokine receptor 4;CXCR4)轴的调控作用下;感染VEGF的EPCs与血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells;VSMCs)在迁移、增殖、凋亡三个方面的相互影响。初步探讨从修复细胞数量、功能及其生物调控轴等多方面进行调控;增强血管内皮化修复;从而抑制血管平滑肌细胞增生;恢复内皮功能的有效性及可能作用机制。 方法 1、内皮祖细胞的分离、培养及鉴定：用密度梯度离心法从SD大鼠骨髓中分离骨髓单个核细胞;用差速贴壁法;收集24h后未贴壁的细胞重新接种;经诱导培养获取EPCs。通过形态学观察、流式细胞术检测细胞表面标志（CD34、CD133和VEGFR-2）、激光共聚焦检测EPCs对FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL的吞噬功能、体外管腔生成能力四个方面对EPCs进行鉴定。 2、感染重组腺病毒VEGF的内皮祖细胞的生物学特性：取生长活跃的 EPCs ;感染携带VEGF-165 基因的腺病毒质粒(Ad-GFP-VEG F165);分组：空白对照组、GFP组、VEGF组。荧光显微镜下观察荧光情况;流式细胞术检测感染效率;QRT-PCR检测感染后VEGF mRNA表达情况;Western blot检测感染后VEGF蛋白表达情况;CCK8法检测感染后EPCs的增殖情况;Transwell法检测感染后EPCs的迁移能力。 3、共培养条件下感染VEGF的内皮祖细胞与血管平滑肌细胞的相互影响：Transwell培养板建立感染Ad-GFP-VEGF165-EPCs和VSMCs共培养模型。共培养模型分组：A组：VSMCs与EPCs;B组：VSMCs与Ad-GFP-EPCs;C组：VSMCs与Ad-GFP-VEGF165-EPCs;D组：SDF-1α+VSMCs与EPCs;E组：SDF-1α+VSMCs与Ad-GFP-EPCs;F组：SDF-1α+VSMCs与Ad-GFP-VEG F165-EPCs;G组：SDF-1α+VS MCs与Ad-GFP-VEGF165-EPCs+AMD3100组。通过Transwell法检测VSMCs、EPCs的迁移能力;CCK-8法检测VSMCs、EPCs的增殖能力;流式细胞术检测VSMCs、EPCs的凋亡情况。 结果 1、重新接种的非贴壁细胞继续培养4天后;细胞呈多角形、三角形及纺锤形;第7天细胞增多;以长梭形细胞为主;培养14天细胞可见“干细胞克隆样”集落;第21天左右细胞呈明显“铺路石”样形态。细胞表达EPCs特异性表面标志物CD34、CD133、VEGFR-2的阳性率分别为(69.61±2.13)%、(83.41±0.11)%、（82.45±0.01)%。摄取Dil-Ac-LDL的细胞呈红色;摄取FITC-UEA-1的细胞呈绿色;两者同时摄入呈橙 黄色荧光的细胞比率为86.3%;双阳性细胞即是正在分化的EPCs。培养21天的细胞可形成管腔。 2、流式细胞术检测显示Ad-GFP-VEG F165对内皮祖细胞的感染效率约72.4%;QRT-PCR检测显示感染后EPCs的VEGFmRNA表达明显上调;Western blot检测显示感染后EPCs的VEGF蛋白表达量明显增高。CCK8法检测显示感染后EPCs的增殖能力增强;Transwell法检测显示感染后EPCs的迁移能力增强。 3、共培养模型中;与空白对照组、GFP组比较;VEGF组、空白对照+SDF-1α组、GFP+SDF-1α组、VEGF+SDF-1α组、VEG F+SDF-1α+AMD3100组VSMCs的迁移能力及细胞存活率下降;凋亡增强（P＜0.05）;其中以VEGF+SDF-1α组VSMCs的迁移能力及细胞存活率下降、凋亡增强最明显（P＜0.05）。与VEGF+SDF-1α组比较;加入拮抗剂AMD3100后;VSMCs迁移能力、细胞存活率明显增高;而凋亡明显减弱（P＜0.05） 4、共培养模型中;与空白对照组、GFP组比较;VEGF组、空白 对 照 +SDF-1 α组 、 GFP+SDF-1α组 、 VEGF+SDF-1α组 、VEGF+SDF-1α+AMD3100组EPCs的增殖、迁移能力增强、凋亡减少（P＜0.05）;其中以VEGF+SDF-1α组EPCs的增殖及迁移能力增强、凋亡减弱最明显（P＜0.05）。与VEGF+SDF-1α组比较;加入拮抗剂AMD3100后;EPCs增殖、迁移能力明显降低;而凋亡能力增强（P＜0.05） 结论 过表达VEGF可增强EPCs的增殖、迁移能力;在SDF-1/CXCR4调控及VEGF的协同作用下;过表达VEGF的EPCs迁移和增殖能力增强、凋亡减弱;并且可加强对VSMCs迁移和增殖的抑制作用;促进其凋亡。

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