三元复合材料纳米羟基磷灰石/聚酰胺66/氧化钇稳定氧化锆的设计、制备及其生物学特性的实验研究

摘要

背景 随着整体医疗水平的提升;临床工作中对生物工程材料的要求也愈来愈高;其主要表现为对生物材料仿生性能的要求提高：低弹性模量、优良的力学性能、生物相容性基础上的生物活性。而在骨科领域;目前金属内植物仍是内固定治疗的第一选择。但金属内植物的高弹性模量、缺乏生物活性、释放出的金属离子有引起人体金属过敏等缺陷现今得到了越来越多的报道与关注。同时;金属内植物往往需二次手术取出;一定程度上又增加了患者的痛苦及花费。另外;诸如纳米羟基磷灰石/聚乳酸、镁合金等近年来在骨科中应用较多的一些可吸收生物材料;也因为其降解产物可能产生细胞毒性或改变局部 pH 值而影响成骨细胞活性等自身缺陷;而限制了其进一步的临床应用。 纳米羟基磷灰石/聚酰胺 66;作为一种仿生生物活性纳米材料;在近年来得到了较多研究与关注。它的仿生特性就体现在与人体骨的组成成分相似;人体骨的组成结构也是由无机物/有机物构成;而其中最主要的组成成分即为羟基磷灰石与I型胶原;聚酰胺66就在其中扮演了 I 型胶原的角色。在既往的研究中;本研究团队主要着眼于在nHA/PA66的基础上;研发出其相关衍生产品;以求满足更为广泛的临床需要。但在研究中;我们发现nHA/PA66虽然具有较优良的生物相容性及生物活性;但其力学性能尚存在一定的提高空间;其衍生产品尚不足以满足对力学性能要求较高的临床治疗所需。故而如何在提高其生物学性能的同时;兼顾提升其力学性能;成为我们研究的重点。氧化锆陶瓷材料是近年来被广泛关注及研究的生物工程材料;甚至在口腔医学领域;有取代钛金属成为首选内植物的趋势。而由其作为增韧成分的复合材料也得到了一些关注与研究。故而;本次研究结合相关研究背景;制备一种由氧化锆增韧的三元复合材料;对其构成进行分析;测试其力学性能;并观察该三元复合材料在体内外的生物相容性及生物活性表现;探讨其作为一种改良型生物工程材料及未来进一步研发应用的可行性。 目的 制备一种由氧化钇稳定氧化锆(yttria-stabilized tetragonal zirconia; YTZ)增韧的三元复合材料纳米羟基磷灰石/聚酰胺 66/氧化钇稳定氧化锆(nano-hydroxyapatite/polyamide 66/yttria-stabilized tetragonal zirconia; nHA/PA66/YTZ);通过材料学检测及体内外实验分析评价其结构构成、测试其力学性能、观察其体内外的生物安全性、生物相容性及生物活性。 方法 1. 将 nHA 与 YTZ 粉末分别以不同质量比(100:0; 90:10; 80:20; 60:40)进行研磨混合;将混合物在1500℃的高温条件下烧结5小时。将烧结后的nHA/YTZ复合材料进行粉碎;并与PA66进行混合注塑制备 nHA/PA66/YTZ 复合材料;采用不同模具制备力学样条、小方片、小圆片及螺钉;另外将 nHA/PA66/YTZ 复合材料采用化学发泡法制备多孔骨填充材料。扫描电镜(scanning electron microscopy; SEM)、X线衍射(X-ray diffraction; XRD)、傅里叶转换红外光谱分析仪(fourier transform infrared spectroscopy; FTIR)观测nHA/YTZ及nHA/PA66/YTZ复合材料的表征及构成;接触角测试仪测试 nHA/PA66/YTZ 复合材料的亲水性;力学测试仪测试 nHA/PA66/YTZ 复合材料的抗弯强度、抗张强度、抗压强度、弹性模量、断裂伸长率等力学参数;评价其力学性能。 2. 制备nHA/PA66/YTZ复合材料浸提液;将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)与复合材料浸提液进行共培养;取共培养后第1天、第4天及第7天三个时间点为观察点;通过CCK-8检测细胞增殖、流式细胞学检测细胞周期来评价该复合材料对细胞的生物相容性及细胞毒性。 3. 将MC3T3-E1细胞与nHA/PA66/YTZ复合材料所制备的小方片在24孔板中进行共培养;并对共培养的细胞行罗丹明标记的鬼笔环肽染色。观察时间点为共培养后24小时;对共培养的细胞进行固定及染色处理后;通过 SEM 及激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy; LSCM)观察评价MC3T3-E1细胞早期在复合材料表面的黏附、增殖情况。 4. 将MC3T3-E1细胞与nHA/PA66/YTZ复合材料所制备的小圆片在6孔板中进行共培养;对MC3T3-E1行成骨诱导培养;通过茜素红染色观察钙结节形成、蛋白免疫印迹实验(western blot; WB)检测I型胶原、骨桥蛋白、骨钙素等成骨相关蛋白的表达情况;评价该生物材料的生物活性作用。 5. 在新西兰大白兔外侧股骨髁建立骨缺损模型;分别植入由nHA/PA66/YTZ 复合材料所制备的多孔骨填充材料及 nHA/PA66 制备的多孔骨填充材料;观察点设置为填充材料植入后 30天及 90天。采用微计算机断层扫描(micro computed temography; Micro-CT)及组织学染色观察分析植入材料周围骨生长情况、植入材料与骨的界面结合情况;同时行动物炎性指标及肝肾功生化指标检测、肝肾组织学观察;以综合评价 nHA/PA66/YTZ 生物材料的生物安全性、生物相容性及生物活性。 6. 在新西兰大白兔股骨髁建立髁间骨折模型;分别植入钛金属螺钉及 nHA/PA66/YTZ 复合材料所制备的生物材料螺钉;观察点设置为内置物植入后30天及90天。采用组织学染色及Micro-CT观察分析植入材料周围骨生长情况、植入材料与骨的界面结合情况;评价nHA/PA66/YTZ制备的生物螺钉的生物相容性、生物活性。 结果 1. 通过SEM观察可见nHA/YTZ烧结后两者结合情况良好;晶粒结构更加致密;观察nHA/PA66/YTZ复合材料断面可见nHA/YTZ颗粒在PA66基体中分散良好;并未见到明显的团聚。通过XRD检测;在nHA/YTZ检测结果中可在2Θ=30.23°; 35.15° 及 50.27°处观察到YTZ的特征峰;而在2Θ=25.87°; 31.79°及 32.19°处可以观察到nHA的特征峰;在 nHA/PA66/YTZ 的检测结果中除能在上诉位置观察到 nHA 与YTZ的特征峰外;还可在2Θ=20.39° and 22.71°处观察到PA66的特征峰。上述结果说明;复合材料中各组分均存在。在FTIR检测中;通过分析比较YTZ;nHA/PA66; nHA/PA66/YTZ的检测结果可发现;YTZ后加入的 nHA/PA66/YTZ 相较 nHA/PA66;两者基团组成并无明显变化;证明YTZ的加入并不影响nHA/PA66原基团构成。力学检测提示随着YTZ含量增加;各项力学指标也呈现上升趋势;nHA/PA66; 10%YTZ/nHA/PA66; 20%YTZ/nHA/PA66及40% YTZ/nHA/PA66的各项力学参数为：抗压强度分别为97.03 ± 4.94 MPa、126.14 ± 6.42 MPa、141.41 ± 10.35 MPa、154.15 ± 12.20 MPa; 抗张强度分别为60.69 ± 2.04 MPa;、78.90 ± 2.652 MPa、111.41 ± 2.7 MPa、122.56 ± 2.95 MPa;抗弯强度分别为72.8 ± 2.06 MPa、94.64 ± 2.678 MPa、113.68 ± 2.616 MPa、119.23 ± 1.77 MPa;断裂伸长率分别为5.28 ± 0.27%、6.864 ± 0.351%、10.66 ± 0.247%、10.71 ± 0.224%;弹性模量分别为1.69 ± 0.37 GPa、2.197 ± 0.481 GPa、2.62 ± 0.51 GPa、3.60 ± 0.237 GPa。相比较nHA/PA66; nHA/PA66/YTZ 复 合 材 料 的 力 学 性 能 明 显 更 优 ; 而 40%YTZ/nHA/PA66 各项力学数据最优;故选取该组分比制备复合材料供后续实验。 2. 通过CCK-8检测MC3T3-E1细胞与nHA/PA66/YTZ复合材料浸提液共培养后的细胞增殖情况;通过与 nHA/PA66 组及空白对照组对比;可以得知三组的细胞增殖情况随培养时间的延长均呈上升趋势;在各观察时间点;三组细胞的增殖情况相似;差异无统计学意义(P>0.05)。另外;流式细胞检测细胞周期提示;nHA/PA66/YTZ 组、nHA/PA66组及空白对照组在不同观察时间点细胞周期情况分别为：第1天;G0G1期11.4±1.02%;10.9±0.87%;12.2±1.33%;S期49.1±5.03%; 49.5±4.11%;51.4±4.79%;M期39.5±3.72%;39.6±4.25%;36.4±4.03%;第4天;G0G1期63.4±5.53%、74.1±5.19%、75.5±5.24%;S期17.4±2.31%、11.6±1.99%、12.3±2.06%;M期19.2±1.95%、14.3±1.73%、12.2±1.96%;第7天;G0G1期76.1 ± 5.17%;78.1 ± 4.26%;77.0 ± 4.39%;S期分别为9.6 ± 2.26%;8.9 ± 1.87%;9.1 ± 2.42%;G2M期分别为14.3 ± 2.75%; 13.0 ± 2.05%;13.9 ± 2.41%。各组中第1天及第7天细胞周期情况相似;差异无统计学意义(P>0.05) ;而第 4 天的细胞周期检测中; nHA/PA66/YTZ组处于S期及G2M期的细胞明显多于nHA/PA66组及空白对照组;差异有统计学意义(P<0.05)。 3. 通过SEM观察可见;MC3T3-E1细胞在nHA/PA66/YTZ复合材料表面的伸展、黏附情况优于 nHA/PA66 组; MC3T3-E1 细胞在nHA/PA66/YTZ 复合材料表面呈纺锤形;并且可见细胞伸出大量伪足黏附于复合材料表面;而黏附于 nHA/PA66 组的细胞不仅从数量上少于nHA/PA66/YTZ组;而且细胞形态呈多边形。通过LSCM观察鬼笔环肽染色细胞骨架可见在nHA/PA66/YTZ组;大量细胞黏附于材料表面;并出现细胞间的聚集、融合、多层现象;而且细胞内可见较多的肌动蛋白丝。而在nHA/PA66组及空白对照组;细胞呈现为单层、散在分布;细胞内肌动蛋白丝亦明显少于nHA/PA66/YTZ组。 4. MC3T3-E1 细胞在与 nHA/PA66/YTZ 复合材料共培养;经 21天成骨诱导培养后;通过茜素红染色染色观察发现;肉眼观nHA/PA66/YTZ 组的染色较 nHA/PA66 组及对照组颜色更深;镜下观nHA/PA66/YTZ 组钙结节生成的数量亦明显多于 nHA/PA66 组及对照组。将复合材料表面的染料洗脱并进行定量检测;nHA/PA66/YTZ组、nHA/PA66组及对照组的吸光度分别为：0.36 ± 0.07、0.19 ± 0.01、0.17 ± 0.03;差异有统计学意义(P<0.05)。WB检测各成骨相关蛋白表达水平提示;在各观察时间点;nHA/PA66/YTZ 组各成骨蛋白表达水平高于nHA/PA66组及对照组;且差异有统计学意义(P<0.05)。 5. 在骨缺损模型的分析中;Micro-CT分析结果提示;在两个观察时间点中;nHA/PA66/YTZ 组及 nHA/PA66 组植入物周围的骨小梁体积(BV)、骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb. N)、骨小梁厚度(Tb. Th)四组数据中;nHA/PA66/YTZ组高于nHA/PA66组;而在骨小梁分离度(Tb. Sp)的比较中;nHA/

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