人胚胎干细胞hESCs对HepG2/A549两种肿瘤细胞的作用研究

摘要

目的：建立hESCs-HepG2、hESCs-A549非接触式共培养体系，探究人胚胎干细胞hESCs体外对人肝癌细胞系HepG2和人肺癌细胞系A549在侵袭迁移、增殖、凋亡等生物学行为方面的影响，为肿瘤的干细胞治疗奠定理论基础。
　　方法：利用Transwell小室将hESCs与HepG2、A549进行共培养，建立hESCs-HepG2、hESCs-A549非接触式共培养体系，为肿瘤细胞提供hESCs微环境。将与hESCs共培养的HepG2、A549作为Co-HepG2、Co-A549实验组；单独培养在小室内的肿瘤细胞作为HepG2、A549对照组。与hESCs共培养后，Transwel法检测HepG2、A549的侵袭、迁移能力；MTT法检测各组细胞的增殖情况，Flow Cytometry检测hESCs对HepG2、A549细胞周期的影响，Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。qRT-PCR、Western Blot检测各组细胞Cyclind1、CDK4、P21、Bax、Bcl2的mRNA转录水平及蛋白表达情况。
　　结果：实验结果显示，与hESCs共培养后，HepG2的侵袭能力显著降低；A549的侵袭能力与对照组比明显降低(P＜0.05)；在迁移实验中，Co-HepG2组中穿过Transwell底膜的细胞数量与HepG2对照组比显著减少(P＜0.05)；Co-A549组通过小室底膜的细胞数量与A549对照组比显著减少(P＜0.05)。与hESCs共培养后，Co-HepG2、Co-A549实验组细胞的增殖能力受到显著抑制，且随着时间增加，该抑制作用越明显(P＜0.05)；Flow Cytometry检测发现Co-HepG2组处于G1期的细胞与HepG2对照组比明显增多(P＜0.05)，Co-A549实验组中G1期细胞与A549对照组比组显著增加；通过qRT-PCR检测细胞周期相关基因的表达量发现：与对照组比，Co-HepG2细胞内CDK4、CyclinD1 mRNA相对表达量显著降低，P21表达著增加(P＜0.05)；Co-A549中CDK4、CyclinD1 mRNA相对表达量与A549对照组比显著降低，P21表达显著增加(P＜0.05)；Western Blot实验结果进一步显示CDK4、CyclinD1、P21蛋白表达趋势与qRT-PCR结果相符，差异具有统计学意义(P＜0.05)。Hoechst凋亡染色实验结果显示Co-HepG2、Co-A549实验组中固缩、变形、出现浓染的细胞核数量较HepG2、A549对照组多；进一步检测发现Co-HepG2细胞凋亡率为16.77%，与HepG2对照组2.93%比显著增加(P＜0.05)，Co-A549组中细胞凋亡率12.73%与A549对照组1.9%比显著增加(P＜0.05)；通过qRT-PCR实验发现：在Co-HepG2中凋亡相关基因Bcl2相对表达与HepG2对照组比显著降低，Bax表达显著增加(P＜0.05)；与A549对照组比，Co-A549中Bcl2 mRNA相对表达量显著降低、Bax表达增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。进一步通过Western Blot实验发现Bcl2、Bax蛋白表达趋势与qRT-PCR实验结果相符。
　　结论：人胚胎干细胞hESCs能够抑制HepG2、A549细胞侵袭与迁移与增殖能力，并且可以促进细胞凋亡。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 人胚胎干细胞hESCs与HepG2/A549共培养体系的建立

1实验材料

1.1 细胞系

1.2 主要试剂

1.3主要实验仪器

1.4 相关试剂的配制

2实验方法

2.1 人胚胎干细胞hESCs的培养

2.2 人肿瘤细胞HepG2与A549的培养

2.3非接触式共培养体系的建立

3结果

4 讨论

第二部分 人胚胎干细胞hESCs对HepG2/A549两种肿瘤细胞侵袭与迁移、增殖、凋亡的影响

1 实验材料

1.1 细胞系

1.2 主要试剂

1.3 主要实验仪器

1.4 相关试剂的配制

2 实验方法

2.1 hESCs对HepG2、A549细胞迁移、侵袭的影响

2.2 MTT法检测hESCs对HepG2、A549细胞增殖的影响

2.3 流式细胞技术（ Flow Cytometry ， FCM ）检测 hESCs 对HepG2、A549细胞周期的影响

2.4 Hoechst染色检测hESCs对HepG2、A549细胞核的影响

2.5 Annexin V-FITC/PI 双染流式凋亡细胞术检测 hESCs 对HepG2、A549细胞凋亡的影响

2.6 荧光定量PCR检测相关基因mRNA表达

2.7 Western-blot检测hESCs对肿瘤细胞的影响

2.8统计学处理

3 实验结果

3.1 Transwell小室法检测细胞迁移与侵袭的能力

3.2 人胚胎干细胞对肿瘤细胞增殖的影响

3.3 hESC对HepG2、A549细胞凋亡的影响

4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述：人胚胎干细胞体外抗肿瘤作用研究

致谢

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