注射用核糖核酸Ⅱ调控人白血病细胞增殖凋亡的分子机制研究

摘要

白血病是一类以不同程度的贫血、出血、感染发热及肝脏、脾脏、淋巴结肿大和骨骼疼痛为临床表现的造血干细胞恶性克隆性疾病[1]。白血病的发病机制极为复杂，与染色体断裂、易位所引起的癌基因激活、抑癌基因失活等多种因素有关[2]。尽管目前临床所采用的骨髓移植、化疗等方法在白血病的治疗方面取得了极大的进展，但因其治疗价格昂贵、配型困难、副作用多等不利因素削弱了这些治疗措施对白血病的治疗效果，迫切需要寻找价格低廉而疗效明显的药物。
　　注射用核糖核酸Ⅱ（Ribonucleic acidⅡ）是免疫核糖核酸的成员之一，具有提高细胞免疫功能和抗肿瘤等作用[3]，对肺癌、胃癌等多种肿瘤细胞具有明显的抗肿瘤药物活性[4]，这一作用主要是诱导肿瘤细胞DNA损伤来实现的。而注射用核糖核酸Ⅱ对于白血病的治疗效果及机制研究极少见报道。
　　磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphoinositide3-kinases，PI3K）是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，可磷酸化细胞膜上的磷脂酰肌醇家族成员[5]。AKT（Protein kinase B，AKT）是一种受磷酸肌醇募集到达质膜后激活的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞存活和凋亡中扮演极其重要角色[6]。PI3K/AKT信号通路可通过激活p53等下游基因影响细胞周期进展、增殖和凋亡，在调控细胞凋亡增殖过程中发挥重要作用[7]。p53还可在DNA受损后通过维持基因组稳定参与DNA的修复过程来调节细胞的增殖凋亡[8]。因此，PI3K/AKT信号通路对肿瘤细胞DNA的影响是多种抗肿瘤药物发挥其作用的重要环节。
　　活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)是需氧细胞在代谢过程中产生的重要分子，参与了体内多种病理生理过程；其中，内源性的ROS对细胞的凋亡起着重要的作用[9]。研究表明，ROS介导PI3K/AKT信号通路及其下游信号分子表达水平的改变在多种肿瘤细胞的凋亡过程中与AKT的活化密切相关[10]。胞内ROS水平改变引起很多抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞DNA片段化导致细胞凋亡[11]。
　　因此，探讨注射用核糖核酸Ⅱ是否具有诱导白血病细胞凋亡的作用，这一抗肿瘤作用是否与PI3K/AKT信号通路和ROS有关，以及二者的关系可否为注射用核糖核酸Ⅱ的临床应用提供实验基础。
　　目的：
　　本研究以人慢性髓系白血病K562细胞和急性髓系白血病KG1a细胞为研究对象，观察注射用核糖核酸Ⅱ对细胞凋亡和周期的影响，研究该药物对K562和KG1a细胞中ROS水平和PI3K/AKT信号通路分子表达的调控作用，进一步探讨其诱导白血病细胞凋亡的作用机制。
　　方法：
　　体外培养人白血病细胞系K562和KG1a细胞，分别加入注射用核糖核酸Ⅱ以100～300 mg·L-1连续培养12、24和48 h，CCK-8法（Cell counting kit-8，CCK-8）检测注射用核糖核酸Ⅱ对K562和KG1a细胞增殖的影响；100、150、200 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ处理K562和KG1a细胞24 h后，采用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）检测注射用核糖核酸Ⅱ对K562和KG1a细胞凋亡和周期的影响及；Hochest染色后荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学改变；免疫印迹法（Western blot，WB）检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT、p-MDM2、p53的表达及其下游周期相关蛋白p21、Cyclin D1、CDK4的表达和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表达；WB检测150 mg·L-1注射用核糖核酸Ⅱ诱导K562和KG1a细胞24 h后，FCM检测白血病细胞中ROS水平改变以及加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)后p-PI3K、p-AKT和p53蛋白的表达变化，探讨注射用核糖核酸Ⅱ诱导白血病细胞凋亡中ROS对PI3K/AKT信号通路影响。
　　结果：
　　1.CCK-8法结果显示：注射用核糖核酸Ⅱ浓度分别采用100、150、200 mg·L-1作用K562和KG1a细胞12、24和48 h后，K562和KG1a细胞的增殖受到显著抑制（P＜0.05），且呈时间和浓度依赖性。
　　2.FCM法检测细胞周期阻滞：K562细胞G0/G1期的周期比例由对照组的22.91%分别增加至28.35%、37.43%、42.40%；KG1a细胞由对照组的23.57%分别增加至28.74%、38.45%、49.77%；细胞周期阻滞在G0/G1期呈浓度依赖（P＜0.05），而G2/M期、S期比例则逐渐减少。
　　3.FCM检测细胞凋亡：100、150、200 mg·L-1的注射用核糖核酸Ⅱ诱导K562和KG1a细胞24 h后,其中K562细胞的凋亡率由空白组4.75%分别增加至为9.21%、15.8%、29.36%；KG1a细胞的凋亡率由空白组6.91%分别增加至为10.06%、56.49%、77.24%；且细胞凋亡率呈浓度依赖性（P＜0.05）。
　　4.Hoechst染色结果显示：随着药物浓度的加大，细胞核出现不同程度的染色质浓缩聚集、核碎裂、核边集及染色加深发出蓝白色荧光，表现出细胞凋亡的典型形态学改变。
　　5.WB结果显示：注射用核糖核酸Ⅱ可以明显上调p53、p21、Bax和cleaved caspase-3的表达；下调p-PI3K、p-AKT、p-MDM2、Bcl-2和Cyclin D1的表达。
　　6.FCM法检测ROS结果显示：随着药物浓度的增加，K562和KG1a细胞胞内ROS水平均逐渐增高，呈药物浓度依赖性（P＜0.05）。
　　7.NAC诱导后WB结果显示：经NAC预处理后再使用注射用核糖核酸Ⅱ诱导白血病细胞，较只用注射用核糖核酸Ⅱ诱导的蛋白水平显著升高了磷酸化PI3K/AKT的表达和降低了p53的表达。
　　结论：
　　1.注射用核糖核酸Ⅱ具有抑制人急、慢性白血病KG1a和K562细胞增殖，阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡的作用。
　　2．注射用核糖核酸Ⅱ可通过调控PI3K/AKT信号通路，激活p53，下调细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4，阻滞细胞周期抑制细胞增殖以及调控Bcl-2/Bax，激活凋亡终末蛋白Caspase-3诱导白血病细胞的凋亡。
　　3．注射用核糖核酸Ⅱ通过增加白血病细胞中ROS含量介导PI3K/AKT的磷酸化和p53的活化，诱导人白血病K562和KG1a细胞的凋亡。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料与方法

1.1 人白血病细胞株

1.2 实验试剂和材料

1.3 实验试剂和材料

1.4 药物及试剂配制

1.5 细胞培养

1.6 细胞增殖实验

1.7 FCM法检测细胞周期

1.8 FCM法检测细胞凋亡

1.9 Hochest 33258染色实验

1.10 Western blot检测PI3K/AKT通路蛋白

1.11 细胞内ROS检测

1.12 NAC诱导后Western blot检测p-PI3K、p-AKT、p53蛋白表达

1.13 统计学分析

2结果

2.1 注射用核糖核酸Ⅱ能有效抑制人白血病细胞K562和KG1a增殖

2.2 注射用核糖核酸Ⅱ阻滞K562和KG1a细胞在G0/G1期

2.3 FCM检测注射用核糖核酸Ⅱ诱导人白血病细胞K562和KG1a细胞凋亡

2.4 Hochest染色观察人白血病细胞K562和KG1a细胞凋亡

2.5 注射用核糖核酸Ⅱ诱导人白血病细胞K562和KG1a调控细胞凋亡相关蛋白的表达

2.6注射用核糖核酸Ⅱ作用K562和KG1a胞内ROS的影响

2.7 NAC和注射用核糖核酸Ⅱ对K562和KG1a细胞p-PI3K、p-AKT、p53表达的影响

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:PI3K/AKT信号通路对人白血病作用机制的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文