新型纳米材料修饰的DNA生物传感器用于VANGL1基因SNP位点检测

摘要

目的：
　　基于聚吡咯/亲和素膜和Au-PAMAM-CP生物纳米复合物探针材料，拟构建一种DNA生物传感器用于神经管畸形相关基因VANGL1的单核苷酸多态性（SNP）（rs4839469 c.346G>A p.Ala116Thr）位点的检测。
　　方法：
　　①利用聚吡咯（PPy）良好的生物相容性和优异的导电性，采用恒电位沉积法将聚吡咯和链霉亲和素一步共沉积到金电极表面。通过三维激光扫描、扫描电子显微镜（SEM）、红外可见吸收光谱（FT-IR）和循环伏安法（CV）对合成的聚吡咯/链霉亲和素膜进行表征；
　　②合成聚酰胺胺树状大分子包裹的金纳米粒子（Au-PAMAM），设计与制备特异性检测VANGL1基因SNP位点的茎环探针作为传感器的捕获探针（CP），以Au-PAMAM作为载体固载CP，制备Au-PAMAM-CP生物纳米复合物探针。同时通过透射电镜、高分辨率透射电镜、FT-IR和紫外可见吸收光谱(UV-Vis)表征Au-PAMAM和Au-PAMAM-CP验证Au-PAMAM-CP是否成功合成；
　　③琼脂糖凝胶电泳验证目标DNA和CP是否杂交成功；
　　④传感器构建过程采用循环伏安法和电化学交流阻抗法表征；
　　⑤采用差分脉冲伏安法（DPV）对聚吡咯/链霉亲和素的电沉积时间、CP和目标DNA的杂交温度和杂交时间以及电极捕获时间进行优化，以提高传感器灵敏度、特异性和准确性；
　　⑥利用传感器检测0.1,1,10,50和100 nM不同浓度目标DNA，通过差分脉冲伏安法进行表征分析获得传感器的检测范围和检测限；
　　⑦验证传感器的特异性、重现性和稳定性；
　　⑧验证传感器的基质效应，并通过标准加样测试其检测性能。
　　结果：
　　①表征分析显示聚吡咯和链霉亲和素膜合成成功；
　　②Au-PAMAM-CP生物纳米复合物探针合成成功；
　　③目标DNA和CP杂交成功；
　　④DNA生物传感器构建成功；
　　⑤优化后的检测条件为：聚吡咯/链霉亲和素的电沉积时间4 min，CP和目标DNA的杂交时间30 min，捕获时间40 min，CP和目标DNA的杂交温度35℃；
　　⑥在最佳实验条件下，VANGL1基因在0.1-100 nM浓度范围内与峰电流的变化值I呈良好的线性关系，最低检出限为0.033 nM（S/N=3）；
　　⑦该传感器能有效识别目标DNA、单碱基错配DNA、三碱基错配DNA和非互补DNA，具有较好的特异性。对10 nM VANGL1基因平行测定5次，相对标准偏差（RSD）为3.1％，具有较好的重现性。传感器在4℃下储存两周后仍保持生物活性，电流响应显示没有显着变化，具有较好的稳定性；
　　⑧该测定法可以忽略实际样品检测时基质的影响，研究所提出的信号放大策略对真实样品有效，人体血样加标回收率为103％~105％。
　　结论：
　　本研究成功构建的DNA生物传感器，具有简单、成本低、灵敏度高、重现性好等优点，可用于检测VANGL1基因SNP位点。该方法为神经管畸形的基因诊断提供了新的思路。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1 材料与方法

1.1试剂与仪器

1.2 Au-PAMAM-CP生物纳米复合探针的合成

1.3 聚吡咯/链霉亲和素膜的制备

1.4 茎环探针的验证

1.5 检测目标DNA

2 结果与讨论

2.1 聚吡咯/链霉亲和素膜的形态和表征

2.2 Au-PAMAM-CP生物纳米复合物探针的表征

2.3 CP的表征

2.4 传感器构建过程的电化学表征

2.5 条件优化

2.6 VANGL1基因的检测

3 结论

参考文献

全文总结

文献综述:导电聚合物聚吡咯和PAMAM树状分子在DNA生物感器中的应用

致谢

攻读硕士期间发表的论文