基于DNAzyme介导生成金纳米颗粒的比色法快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素B

摘要

目的：
　　基于卟啉铁/G-四链体结构的 DNAzyme介导金纳米颗粒生成导致的颜色改变，联合适配体作为识别探针构建通用型的比色法检测平台，并以SEB作为待检物的代表，对新构建的比色检测平台进行评价和性能确认。
　　方法：
　　⑴金纳米颗粒的生成：在2-(N-吗啉基)乙磺酸(2-(N-morpholino) ethanesulphonic acid, MES)缓冲液中，利用不同浓度的过氧化氢将氯金酸还原成不同分散状态的金纳米颗粒，并对其进行表征。⑵具有辣根过氧化物酶活性的 DNAzyme的形成：探针 G和 SEB适配体在反应液中发生杂交反应，加入SEB和卟啉铁，适配体可特异性与 SEB结合，探针 G与卟啉铁形成具有辣根过氧化物酶活性的DNAzyme。⑶比色传感器的构建：利用目标物介导DNAzyme生成，进一步控制金纳米颗粒的合成速度，定量检测样本中的SEB。⑷检测条件的优化：对MES缓冲液浓度、氯金酸浓度，过氧化氢浓度，检测时间及适配体和探针G的核酸序列进行优化，以提高信噪比。⑸新构建比色法的性能评价：对传感器的最低检测限、线性范围、特异性进行评价。⑹实际标本的检测：将已经构建好的比色生物传感器用于血清样本的检测。
　　结果：
　　①用紫外可见分光光度计、动态光散射、透射电镜对生成的金纳米粒子分别进行光谱学和形态学的表征分析。蓝色和红色金纳米颗粒溶液的紫外可见吸收光谱最大吸收峰分别在604 nm和557 nm处。动态光散射检测得到两种状态的金纳米颗粒的水动力平均直径为282.4 nm和61.9 nm，分布系数为0.347和0.094。透射电镜可见呈均一分散状态和多不规则聚集状态的两种金纳米颗粒。②用琼脂糖凝胶电泳对探针 G和适配体的杂交反应进行表征，结果表明随着SEB浓度的增加，杂交双链逐渐解离。紫外可见分光光度计对DNAzyme的生成进行验证，随着SEB的增加，DNAzyme的生成也增加。③当目标物加入到构建的比色传感器，DNAzyme生成，降低了金纳米颗粒的生成速率，纳米颗粒溶液呈现蓝色，从而实现目标物的检测。④优化实验得到的最佳条件为：MES缓冲液的浓度为2 mM，氯金酸的浓度为0.3 mM，过氧化氢的浓度120μM，检测时间反应后15 min，适配体选用APTSEB1，探针G选用G3。⑤在最优条件下对新构建的比色传感器进行评价：SEB浓度在0.1 pg mL-1-1000 pg mL-1范围内与550 nm处降低的吸光度值呈线性相关，R2=0.9895；SEB肉眼可识别的最低检测限为1 pg mL-1；该传感器能特异识别 SEB，在高浓度 BSA、凝血酶、IgG存在的情况下，均只产生微弱的背景信号。⑥在血清中加入SEB，配制三组不同浓度的SEB(10 pg mL-1,100 pg mL-1,1000 pg mL-1)，该法测得的结果与缓冲液配制相同浓度的SEB检测结果无明显差异，表明该传感器可以正确检测血清等复杂基质的临床样本。
　　结论：
　　构建了基于卟啉铁/G-四链体结构的 DNAzyme介导金纳米颗粒生成的比色法检测平台，该传感器无酶无修饰，操作简单。用于检测SEB时灵敏度高，检测线性范围宽，特异性好，并可用于临床血清样本中SEB的检测。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料和仪器

1.1材料

1.2仪器

2实验方法

2.1金纳米颗粒的生成以及表征

2.2适配体识别目标物的可行性分析

2.3实验条件的优化

2.4比色法检测金黄色葡萄球菌肠毒素B

2.5实际标本的检测

3结果与分析

3.1比色传感器的构建

3.2金纳米颗粒的生成和表征

3.3适配体特异识别过程的可行性分析

3.4可视化传感器的灵敏度

3.5可视化传感器的特异性

3.6实际标本的检测

4小结

全文总结

参考文献

文献综述:金纳米颗粒在生物传感技术中的发展及应用

致谢

攻读硕士期间发表的论文