全反式维甲酸抑制大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化信号通路中Fosl1直接调控PPARγ2

摘要

目的：研究激活蛋白（activator protein-1，AP-1）在全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）抑制大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）成脂分化信号通路中的调控机制。
　　方法：采用SD大鼠原代BMSCs，体外分离，培养和成脂分化诱导。油红 O染色鉴定细胞成脂分化中脂滴形成情况。成脂诱导在第1天，第5天，第9天的同一时间点添加浓度为1μmol/L ATRA，持续处理24小时（即成脂分化诱导第2天，第6天，第10天），收取细胞样本。应用荧光实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）检测脂肪细胞形成相关基因脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding protein，FABP）、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂肪酸转运蛋白（CD36）、脂滴包被蛋白（Perilipin）、过氧化物酶体增殖激活受体-γ2（peroxisome proliferator-activated receptor gamma-2，PPARγ2）以及AP-1家族各成员（Fosl1，Fosl2，c-Fos，FosB，c-Jun，JunB，JunD）基因表达水平。Western blot检测蛋白表达水平。染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）检测相关蛋白（RARγ，Fosl1）与PPARγ2基因是否存在相互作用。
　　结果：（1）油红 O染色结果显示，ATRA处理组中细胞形成的脂滴数量明显减少，且油红染料吸光度OD值明显下降。（2）BMSCs成脂诱导12天后，RT-PCR结果显示，与对照组相比，1μmol/L ATRA处理组脂肪细胞形成相关基因 FABP，LPL，CD36，Perilipin，PPARγ2表达均显著降低（PFABP＜0.05，PLPL＜0.001，PCD36＜0.001，PPerilipin＜0.05），P＜0.05差异具有统计学意义。（3）RT-PCR检测AP-1家族各转录因子表达，Fosl1在ATRA处理组成脂诱导第2天，第6天，第10天mRNA表达水平均显著升高（P第2天＜0.01，P第6天＜0.01，P第10天＜0.001）。Westren blot结果显示，ATRA处理组Fosl1蛋白表达显著升高，而PPARγ2蛋白表达明显下降。（4）ChIP-qPCR结果表明，Fosl1蛋白可结合在PPARγ2基因启动子区域，而RARγ蛋白未直接结合在PPARγ2基因启动子上。
　　结论：ATRA可抑制BMSCs成脂分化及脂质代谢相关基因的表达，可能通过上调 Fosl1直接结合 PPARγ2基因启动子区域下调其表达有关。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞提取及原代培养

1.2.2 原代骨髓间充质干细胞体外成脂诱导分化

1.2.3 油红O染色

1.2.4 总mRNA提取和荧光定量PCR

1.2.5 总蛋白提取和Western blot

1.2.6 CHIP-qPCR检测

1.2.7 启动子序列查找和转录因子结合位点预测

1.2.8 统计学方法

2结果

2.1 ATRA抑制BMSCs向脂肪细胞分化

2.2 ATRA对BMSCs成脂分化中脂质代谢相关基因mRNA及蛋白表达的影响

2.3 ATRA对BMSCs成脂分化过程中AP-1家族各转录因子mRAN及蛋白表达的影响。

2.4 ChIP-qPCR检测RARγ，Fosl1与PPARγ2基因是否存在相互作用。

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:维生素A与肥胖的研究进展

致谢

硕士期间发表的文章及参加学术交流