UHRF2通过其RING结构域与TIP60作用进而调控组蛋白H3K9和H3K14乙酰化水平

摘要

背景：
　　UHRF2是一个具有E3泛素连接酶的多结构域核蛋白，参与细胞周期、DNA损伤修复、表观遗传学和泛素-蛋白酶体系统。我们课题组在前期研究工作中证实UHRF2参与调控HBV的转录与复制，并调节与cccDNA结合的组蛋白H3乙酰化水平。近期的研究发现UHRF2与组蛋白H3K9ac和H3K14ac存在相互结合作用。本课题基于上述研究成果，继续对UHRF2与组蛋白乙酰化之间的调控机制进行深入探索。
　　方法：
　　本文主要通过western blot实验验证UHRF2对H3K9ac、H3K14ac、TIP60、H2AK5ac和 HDAC1的调控作用关系；免疫共沉淀（Co-IP）实验验证UHRF2与TIP60和HDAC1的相互作用关系；免疫荧光染色（IF）实验验证UHRF2与TIP60和HDAC1的细胞亚定位关系；半衰期实验验证UHRF2对TIP60半衰期的调控作用关系；体内泛素化实验验证UHRF2对TIP60的泛素化作用关系；免疫组织化学染色（IHC）实验验证UHRF2与H3K9ac、H3K14ac、TIP60和H2AK5a之间的调控关系。
　　结果：
　　1）western blot实验证实，在正常细胞中过表达UHRF2可上调H3K9ac及H3K14ac的表达，而在肿瘤细胞中过表达UHRF2则抑制H3K9ac及H3K14ac的表达。干扰UHRF2与过表达UHRF2结果一致。
　　2）western blot实验证实，在HEK293、LO2和HepG2细胞中缺失UHRF2的YDG结构域或RING结构域可废除UHRF2对H3K9ac及H3K14ac的调控作用。
　　3）Co-IP和IF实验证实，UHRF2与TIP60和HDAC1存在共同定位和相互结合作用，且UHRF2的YDG结构域、PHD结构域和RING结构域对UHRF2与TIP60的结合作用至关重要，缺失这些结构域可显著降低UHRF2与TIP60的结合作用，而对UHRF2与HDAC1的结合无显著影响。
　　4）Western blot实验证实，在正常细胞中过表达UHRF2可上调TIP60的表达及酶活性，而在肿瘤细胞中过表达UHRF2则可抑制TIP60的表达及酶活性，对于HDAC1的表达无显著调控作用。且UHRF2对TIP60的调控作用会随着蛋白酶体抑制剂MG132的加入而被废除。
　　5）半衰期实验证实，在正常细胞（HEK293和LO2细胞）中过表达UHRF2可延长TIP60的半衰期，而在肿瘤细胞（HepG2细胞）中过表达UHRF2则可加速TIP60的降解速率，且UHRF2蛋白RING结构域的缺失可废除这一调控作用。
　　6）体内泛素化实验证实，在正常细胞（HEK293和LO2细胞）中过表达UHRF2可增加TIP60的泛素化，而在肿瘤细胞（HepG2细胞）中过表达UHRF2则可抑制TIP60的泛素化。
　　7）Western blot实验证实，在HEK293、LO2细胞和HepG2细胞中过表达TIP60可上调H3K9ac及H3K14ac的表达，干扰TIP60则可抑制H3K9ac及H3K14ac的表达。
　　8）Western blot实验证实，过表达UHRF2的同时干扰TIP60，废除了UHRF2对H3K9ac及H3K14ac的调控作用；同时过表达UHRF2和TIP60则可进一步上调H3K9ac及H3K14ac的表达；当我们应用TIP60抑制剂 MG149处理细胞时，无论过表达野生型UHRF2还是UHRF2各结构域突变体均无法继续对H3K9ac及H3K14ac进行调控。
　　9）免疫组织化学实验证实，在UHRF2高表达的肝癌组织中，TIP60、H2AK5ac、H3K9ac和H3K14ac呈现低表达，而在癌旁组织中，UHRF2的高表达则伴随着TIP60、H2AK5ac、H3K9ac和H3K14ac的高表达。
　　结论：
　　在正常细胞（HEK293和LO2细胞）中，UHRF2延长TIP60的半衰期，可上调TIP60的蛋白表达量及酶活性，从而上调H3K9ac及H3K14ac的表达量，而在肿瘤细胞（HepG2细胞）中，UHRF2可加速TIP60的降解速率，抑制TIP60的蛋白表达量及酶活性，进而抑制H3K9ac及H3K14ac的表达。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一章 UHRF2对组蛋白H3K9及H3K14乙酰化的调控作用研究

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果

2.1上调UHRF2对H3K9ac及H3K14ac的调控作用

2.2下调UHRF2对H3K9ac及H3K14ac的调控作用

2.3 UHRF2各缺失结构域突变体对H3K9ac及H3K14ac的调控作用

3讨论

第二章 UHRF2对TIP60及HDAC1的调控作用研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 UHRF2与TIP60和HDAC1的相互作用

2.2 UHRF2各结构域与TIP60和HDAC1的相互作用

2.3 UHRF2各结构域与TIP60和HDAC1的定位关系

2.4 上调UHRF2对HDAC1和TIP60的调控作用

2.5 下调UHRF2对HDAC1和TIP60的调控作用

2.6 UHRF2各结构域在HDAC1和TIP60的调控中扮演的角色

2.7 UHRF2对TIP60稳定性的调节作用

2.8 UHRF2对TIP60的泛素化作用

3 讨论

第三章UHRF2通过TIP60调控组蛋白H3K9及H3K14乙酰化的调控作用研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 上调TIP60对H3K9ac及H3K14ac的调控作用

2.2 下调TIP60对H3K9ac及H3K14ac的调控作用

2.3 上调UHRF2的同时下调TIP60，对H3K9ac及H3K14ac的影响

2.4 下调UHRF2的同时上调TIP60，对H3K9ac及H3K14ac的影响

2.5 UHRF2是通过TIP60来介导调控H3K9ac及H3K14ac的

2.6 检测肝癌组织中UHRF2、TIP60、H2AK5ac、H3K9ac和H3K14ac的表达情况

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:表观遗传学研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文