成骨细胞葡萄糖代谢在WNT所致骨量增加中的作用及机制研究

摘要

WNT蛋白是一组分泌型糖蛋白家族，能与细胞表面基质及其特异性FZD受体结合后发挥信号传导作用。目前已知的Wnt信号传导通路包括经典的Wnt/p-catenin通路、非经典的Wnt/PCP通路以及Wnt/Ca2+通路等。经典Wnt通路配体如WNT3A、WNT10B与FZD受体结合后，形成WNT/FZD/LRP复合物，使细胞质内β-catenin逐渐累积并转移至细胞核内，与TcPLef结合，启动目的基因的表达；非经典Wnt通路配体如WNT5A、WNT11则可与FZD受体结合，激活DAMM1或GaPy，发挥调节细胞粘附性或活性的效应。 经典及非经典Wnt信号通路在成骨细胞分化、活性、生命早期骨形成及随后的骨重建过程中都具有必不可少的作用。LRP5/6是经典Wnt通路上重要的一环，当其存在时，细胞质内β-catenin才不会被降解而得以积累。早期的人类遗传学研究即发现，LRP5的功能性缺失或过表达都将引起骨量的异常，分别可导致骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征或髙骨密度综合征。转基因模式动物的研究也证实了Wnt信号通路与骨形成之间的因果关系，例如心p5敲除鼠骨量减少，而过表达鼠则表现为骨量增加，这与人类遗传学研究结果一致。与此同时，WNT7B可通过活化mTORCl通路达到促进成骨、增加骨量的效果。 葡萄糖是大多数细胞的主要能量来源，其通过葡萄糖转运蛋白家族（GLUT)以不消耗ATP的方式顺浓度梯度进入细胞内，在细胞质中进行糖酵解，产生2分子丙酮酸、2分子ATP，以及2分子NADH。早期研究已明确葡萄糖是成骨细胞重要营养物质之一。同时，成骨细胞内葡萄糖代谢过程可被多种成骨剌激因子所活化，例如在ST2细胞中，WNT-LRP5可通过mTORC2-Akt途径上调G/m"、Hk2、Uha和八砍7的表达，达到促进成骨分化的效果。这提示Wnt信号通路、细胞葡萄糖代谢与成骨分化之间存在直接联系。但是，以上结果仅为细胞层面证据，目前尚没有遗传学实验在动物体内证明糖代谢对于Wnt信号通路作用的贡献。 本课题将通过体内实验与体外细胞学实验，探讨成骨系细胞葡萄糖代谢在WNT所致骨量增加中的作用以及可能的细胞与分子机制。具体研究内容分为两个部分：（1)构建OsxCreERT2;Rosa26-Wnt7b;Glut1f/f及OsxCreERT2;Rosa26-Wnt7b;Ldhaf/f小鼠，特异性地在成骨系细胞过表达Wnt7b及敲餘GhiU或Ldha,观察骨量变化情况以及骨形成、骨吸收能力，进行表型研究；（2)培养特定基因型小鼠的原代成骨系细胞，构建特定基因过表达及敲除的细胞模型，测定其分化能力、矿化能力与葡萄糖代谢指标，检测相应的基因与蛋白表达情况，在细胞与分子层面探讨葡萄糖糖代谢参与调控WNT功能的机制。 研究结果： 1.WNT7B的促成骨效应迅速且强烈，仅1周即可显著增加松质骨骨量。在WNT7B过表达小鼠中，血清成骨指标明显增高，且组织学检测可见成骨细胞数量、活性等均远髙于对照小鼠。股骨免疫荧光结果显示，WNT7B过表达小鼠成骨系细胞P-S6蛋白表达明显增加，这与既往研究结果相符，即WNT7B通过激活mTORCl信号通路而发挥促成骨效应。 2.成骨系细胞GLUT1在WNT7B所致的骨量增加中具有重要作用，GLUT1的敲除可很大程度上抵消WNT7B诱导的成骨细胞活跃与骨量增加。具体表现为，敲除GLUT1后，成骨细胞数量虽然并未显著减少，但矿物质堆积速度与骨量明显减少，提示缺乏GLUT1的成骨细胞无法发挥正常功能。此效应在无WNT7B过表达的基础状态下并未出现，考虑是由于基础骨重建速度较慢，微观上虽然成骨细胞功能受抑，但其宏观效应在短时间内尚不显著；而当给予WNT信号刺激，成骨细胞活性被动员时，本应加快进行葡萄糖代谢以满足需要的成骨细胞由于缺乏GLUT1，显示出功能的不足。我们同时发现，成骨系细胞LDHA条件性敲除不管在基础状态下还是WNT信号剌激下均不会对骨量产生影响，说明葡萄糖作为最基本的能量及原材料来源，阻断其进入细胞的通道将严重影响细胞功能的发挥，而葡萄糖在细胞内的代谢方式则更加具有灵活性和可适应性，即使阻止其进行有氧糖酵解，仍可通过其他方式如三羧酸循环而发挥作用。 3.体外细胞学实验表明，成骨系细胞WNT7B过表达可增加GLUT1表达水平，并相应地提髙细胞葡萄糖代谢能力，成骨细胞标志分子以及蛋白质合成代谢标志分子的表达也明显上调，最终的结果即是细胞增殖、分化加快、矿化增多。 4.体外实验中，不管有无WNT7B过表达，Glutl敲除均会抑制细胞葡萄糖代谢能力、成骨分化潜能以及细胞矿化功能。Glut2、3、4虽然也被认为是细胞葡萄糖转运的参与者之一，qPCR结果发现，Glutl的表达远远髙于这三者（约100倍)，特别是Glut2及Glut4在成骨系细胞中几乎无表达。此外，即使Glut1被敲除后，Glut2,3,4的表达亦无显著改变，提示它们并未发挥代偿功能。然而，综合细胞葡萄糖代谢及G/如基因的表达情况，Glutl的敲除率与细胞葡萄糖消耗的减少程度之间存在差异，说明在我们常规所了解的葡萄糖转运体之外，成骨细胞尚存在其他后备的葡萄糖转运途径。另一方面，当GLUT1敲除后，P-S6蛋白表达并未受到明显影响，但WNT7B促成骨分化的作用下降，说明GLUT1可能是在mTORCl下游发挥作用。 WNT蛋白是一组分泌型糖蛋白家族，能与细胞表面基质及其特异性FZD受体结合后发挥信号传导作用。目前已知的Wnt信号传导通路包括经典的Wnt/p-catenin通路、非经典的Wnt/PCP通路以及Wnt/Ca2+通路等。经典Wnt通路配体如WNT3A、WNT10B与FZD受体结合后，形成WNT/FZD/LRP复合物，使细胞质内β-catenin逐渐累积并转移至细胞核内，与TcPLef结合，启动目的基因的表达；非经典Wnt通路配体如WNT5A、WNT11则可与FZD受体结合，激活DAMM1或GaPy，发挥调节细胞粘附性或活性的效应。 经典及非经典Wnt信号通路在成骨细胞分化、活性、生命早期骨形成及随后的骨重建过程中都具有必不可少的作用。LRP5/6是经典Wnt通路上重要的一环，当其存在时，细胞质内β-catenin才不会被降解而得以积累。早期的人类遗传学研究即发现，LRP5的功能性缺失或过表达都将引起骨量的异常，分别可导致骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征或髙骨密度综合征。转基因模式动物的研究也证实了Wnt信号通路与骨形成之间的因果关系，例如心p5敲除鼠骨量减少，而过表达鼠则表现为骨量增加，这与人类遗传学研究结果一致。与此同时，WNT7B可通过活化mTORCl通路达到促进成骨、增加骨量的效果。 葡萄糖是大多数细胞的主要能量来源，其通过葡萄糖转运蛋白家族（GLUT)以不消耗ATP的方式顺浓度梯度进入细胞内，在细胞质中进行糖酵解，产生2分子丙酮酸、2分子ATP，以及2分子NADH。早期研究已明确葡萄糖是成骨细胞重要营养物质之一。同时，成骨细胞内葡萄糖代谢过程可被多种成骨剌激因子所活化，例如在ST2细胞中，WNT-LRP5可通过mTORC2-Akt途径上调G/m"、Hk2、Uha和八砍7的表达，达到促进成骨分化的效果。这提示Wnt信号通路、细胞葡萄糖代谢与成骨分化之间存在直接联系。但是，以上结果仅为细胞层面证据，目前尚没有遗传学实验在动物体内证明糖代谢对于Wnt信号通路作用的贡献。 本课题将通过体内实验与体外细胞学实验，探讨成骨系细胞葡萄糖代谢在WNT所致骨量增加中的作用以及可能的细胞与分子机制。具体研究内容分为两个部分：（1)构建OsxCreERT2;Rosa26-Wnt7b;Glut1f/f及OsxCreERT2;Rosa26-Wnt7b;Ldhaf/f小鼠，特异性地在成骨系细胞过表达Wnt7b及敲餘GhiU或Ldha,观察骨量变化情况以及骨形成、骨吸收能力，进行表型研究；（2)培养特定基因型小鼠的原代成骨系细胞，构建特定基因过表达及敲除的细胞模型，测定其分化能力、矿化能力与葡萄糖代谢指标，检测相应的基因与蛋白表达情况，在细胞与分子层面探讨葡萄糖糖代谢参与调控WNT功能的机制。 研究结果： 1.WNT7B的促成骨效应迅速且强烈，仅1周即可显著增加松质骨骨量。在WNT7B过表达小鼠中，血清成骨指标明显增高，且组织学检测可见成骨细胞数量、活性等均远髙于对照小鼠。股骨免疫荧光结果显示，WNT7B过表达小鼠成骨系细胞P-S6蛋白表达明显增加，这与既往研究结果相符，即WNT7B通过激活mTORCl信号通路而发挥促成骨效应。 2.成骨系细胞GLUT1在WNT7B所致的骨量增加中具有重要作用，GLUT1的敲除可很大程度上抵消WNT7B诱导的成骨细胞活跃与骨量增加。具体表现为，敲除GLUT1后，成骨细胞数量虽然并未显著减少，但矿物质堆积速度与骨量明显减少，提示缺乏GLUT1的成骨细胞无法发挥正常功能。此效应在无WNT7B过表达的基础状态下并未出现，考虑是由于基础骨重建速度较慢，微观上虽然成骨细胞功能受抑，但其宏观效应在短时间内尚不显著；而当给予WNT信号刺激，成骨细胞活性被动员时，本应加快进行葡萄糖代谢以满足需要的成骨细胞由于缺乏GLUT1，显示出功能的不足。我们同时发现，成骨系细胞LDHA条件性敲除不管在基础状态下还是WNT信号剌激下均不会对骨量产生影响，说明葡萄糖作为最基本的能量及原材料来源，阻断其进入细胞的通道将严重影响细胞功能的发挥，而葡萄糖在细胞内的代谢方式则更加具有灵活性和可适应性，即使阻止其进行有氧糖酵解，仍可通过其他方式如三羧酸循环而发挥作用。 3.体外细胞学实验表明，成骨系细胞WNT7B过表达可增加GLUT1表达水平，并相应地提髙细胞葡萄糖代谢能力，成骨细胞标志分子以及蛋白质合成代谢标志分子的表达也明显上调，最终的结果即是细胞增殖、分化加快、矿化增多。 4.体外实验中，不管有无WNT7B过表达，Glutl敲除均会抑制细胞葡萄糖代谢能力、成骨分化潜能以及细胞矿化功能。Glut2、3、4虽然也被认为是细胞葡萄糖转运的参与者之一，qPCR结果发现，Glutl的表达远远髙于这三者（约100倍)，特别是Glut2及Glut4在成骨系细胞中几乎无表达。此外，即使Glut1被敲除后，Glut2,3,4的表达亦无显著改变，提示它们并未发挥代偿功能。然而，综合细胞葡萄糖代谢及G/如基因的表达情况，Glutl的敲除率与细胞葡萄糖消耗的减少程度之间存在差异，说明在我们常规所了解的葡萄糖转运体之外，成骨细胞尚存在其他后备的葡萄糖转运途径。另一方面，当GLUT1敲除后，P-S6蛋白表达并未受到明显影响，但WNT7B促成骨分化的作用下降，说明GLUT1可能是在mTORCl下游发挥作用。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分成骨细胞葡萄糖代谢对WNT7B促成骨作用调控的体内研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分Wnt7b过表达、Glut1敲除对成骨系细胞分化及功能影响的细胞及分子研究

1材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述:骨与糖代谢

1 前言

2 细胞糖代谢

3 成骨细胞糖代谢

4 破骨细胞糖代谢

5 临床意义

6 结论

参考文献

致谢

博士期间发表的论文