冷诱导RNA结合蛋白促进冷冻保存大鼠坐骨神经异体移植后神经再生的研究

摘要

目的： 探讨冷诱导RNA结合蛋白（cold-inducible RNA binding protein，CIRP）对冷冻保存大鼠坐骨神经活性及同种异体移植后神经再生的影响。 方法： 176条15 mm雄性SD大鼠坐骨神经片段置于DMEM溶液中，分别在4℃、15℃、32℃预处理24 h（A组：4℃组，B组：15℃组，C组：32℃组），设置新鲜神经对照组（D组），Real-time PCR和Western blot检测CIRP基因及蛋白表达。将上述四组神经置于冷冻保存液中液氮保存4周，钙黄绿素/碘化丙啶（Calcein-AM/propidium iodide, Calcein-AM/PI）荧光染色、激光共聚焦显微镜观察保存后神经活细胞、死细胞情况，Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达。取冷冻保存4周的坐骨神经，于37℃、5% CO2孵箱中培养7天，Western blot检测NGF、GDNF蛋白表达。用冷冻保存4周或新鲜雄性SD大鼠坐骨神经（E组：新鲜神经组），修复对应的雄性Wistar大鼠坐骨神经10 mm缺损（A′：同种异体移植4℃组、B′：同种异体移植15℃组、C′：同种异体移植32℃组、D′：同种异体移植对照组、E′组：新鲜神经同种异体移植组），设立同系移植新鲜组（F′组）。术后4周，免疫组化染色观察移植段神经CD4+T淋巴细胞入侵，ELISA检测血清IL-6、IFN-γ水平；术后20周，电生理检测肌肉复合动作电位（compound muscle action potential,CMAP）和运动神经传导速度（motor nerve conduction velocity,MNCV），甲苯胺蓝染色分析再生有髓神经纤维数目和髓鞘厚度，电镜观察再生神经超微结构。 结果： C组神经CIRP mRNA及蛋白表达均显著高于A、B组（P＜0.05）。冷冻保存4周后，与A、B、D组相比，C组神经活细胞数量较多，Bax表达降低，Bcl-2表达升高；冷冻保存神经NGF、GDNF表达，C组均显著高于A、B组（P＜0.05）。同种异体移植术后4周，CD4+ T淋巴细胞入侵和血清IL-6、IFN-γ水平，与E′组相比，C′组显著降低且具有统计学差异（P＜0.05），但C′组与D′、F′组比较无统计学差异（P＞0.05）。术后20周，C′组CMAP、MNCV、再生神经轴突密度及髓鞘厚度均显著优于A′、B′、D′组及E′组（P＜0.05），与F′组相近；再生神经超微结构显示，与A′、B′、D′组及E′组相比，C′、F′组有髓神经纤维数量多，纤维粗细均匀，分布广泛、髓鞘厚。 结论： 在32℃预处理可促进坐骨神经CIRP高表达，CIRP高表达对冷冻保存大鼠坐骨神经具有保护作用，能维持保存后神经的生物活性，促进同种异体移植后受体神经再生。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1.1材料与仪器

1.2方法

2结果

2.1预处理神经CIRP mRNA及蛋白水平

2.2坐骨神经冷冻保存后观察

2.3同种异体神经移植后检测

3讨论

参考文献

附图

文献综述:CIRP的细胞保护作用研究进展

致谢

攻读硕士期间发表论文

攻读硕士学位期间参与的课题