青蒿琥酯对铜绿假单胞菌生物膜的影响及机制初步探讨

摘要

目的： 研究青蒿琥酯对铜绿假单胞菌生物膜形成及结构的影响，并对其机制进行初步探讨。 方法： 选取铜绿假单胞菌野生株PAO1，分光光度法测定青蒿琥酯对铜绿假单胞菌浮游菌生长的影响。结晶紫染色后测定570nm波长光密度值，以观察24h时细菌生物膜量。采用体外静态模型培养3天获得成熟生物膜，经不同浓度的青蒿琥酯处理后利用平板稀释计数法计算活菌数。利用激光扫描共聚焦显微镜成像技术(CLSM)结合生物膜定量分析软件 COMSTAT对生物膜的单位面积生物量、平均厚度、粗糙系数、平均扩散距离进行定量分析。利用平板稀释计数法观察青蒿琥酯联合亚抑菌浓度（1/2MIC,1/4MIC）的环丙沙星对生物膜内的活菌数量的影响，以观察二者是否有协同作用。另外通过颤搐运动实验检测青蒿琥酯对铜绿假单胞菌颤搐运动距离的影响，Ferrozine法检测青蒿琥酯对铜绿假单胞菌生物膜中 Fe(Ⅱ)的影响。最后观察青蒿琥酯联合Fe(Ⅱ)对铜绿假单胞菌生物膜内活菌数及结构的影响。 结果： 青蒿琥酯对铜绿假单胞菌浮游菌无明显抑制作用。建模3d后，生物膜经不同浓度的青蒿琥酯干预12h后，512μg/mL、1024μg/mL组生物膜内的活菌数与对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。同样，青蒿琥酯512μg/mL、1024μg/mL组在24h时生物膜量显著下降，与对照组相比有统计学差异。与对照组相比，经青蒿琥酯512μg/mL、1024μg/mL组处理后生物膜生物量、平均厚度以及平均扩散距离等结构指标数值都有明显减少(p＜0.05)，但粗糙系数增加(p＜0.05)。青蒿琥酯与亚抑菌浓度的环丙沙星没有协同作用。另外，与对照组相比，青蒿琥酯组铜绿假单胞菌的颤搐运动距离增加，生物膜中 Fe(Ⅱ)的含量降低。与青蒿琥酯组比，青蒿琥酯联合 Fe(Ⅱ)能够增加生物膜内活菌数(p＜0.05)，但较对照组是降低的(p＜0.05)。COMSTAT软件分析结果示与青蒿琥酯组相比，青蒿琥酯联合 Fe(Ⅱ)组生物膜生物量、平均厚度以及平均扩散距离等结构指标数值都有明显增加(p＜0.05)，粗糙系数降低(p＜0.05)，但与对照组相比无统计学差异。 结论： 青蒿琥酯能够刺激铜绿假单胞菌的颤搐运动，干预铜绿假单胞菌生物膜的形成；而且可能通过降低生物膜中 Fe(Ⅱ)，减少生物膜内活菌数，破坏成熟生物膜的结构。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料

1.1实验菌株

1.2实验材料与试剂

1.3 仪器与设备

2 方法

2.1配制LB培养基及LB培养琼脂平板

2.2 配制实验主要试剂

2.3 细菌复苏及接种

2.4不同浓度的青蒿琥酯对铜绿假单胞菌PAO1浮游菌生长曲线的影响

2.5生物膜模型构建

2.6不同浓度的青蒿琥酯对铜绿假单胞菌生物膜内活菌数的影响

2.7青蒿琥酯对铜绿假单胞菌生物膜形成能力的影响

2.8青蒿琥酯对铜绿假单胞菌颤搐运动的影响

2.9激光共聚焦观察生物膜

2.10 COMSTAT软件分析生物膜结构

2.11环丙沙星MIC

2.13 Ferrozine法检测生物膜内铁的含量

2.14青蒿琥酯联合铁离子对铜绿假单胞菌生物膜内活菌数影响

2.15激光共聚焦联合COMSTAT软件分析青蒿琥酯联合铁离子对铜绿假单胞菌生物膜结构的影响

2.16统计分析

3 结果

3.1不同浓度青蒿琥酯对铜绿假单胞菌PAO1生长的影响

3.2不同浓度的青蒿琥酯对铜绿假单胞菌生物膜内活菌数的影响

3.3青蒿琥酯对铜绿假单胞菌生物膜形成能力的影响

3.4激光共聚焦观察生物膜

3.5 COMSTAT软件分析生物膜结构

3.6青蒿琥酯与亚抑菌浓度环丙沙星联合应用对生物膜内活菌数的影响

3.7青蒿琥酯对铜绿假单胞菌颤搐运动的影响

3.8 Ferrozine法检测生物膜内Fe（Ⅱ）的含量

3.9青蒿琥酯联合铁离子对铜绿假单胞菌生物膜内活菌数影响

3.10激光共聚焦联合COMSTA软件分析青蒿琥酯联合铁离子对铜绿假单胞菌生物膜的影响

4讨论

总结

参考文献

文献综述:铜绿假单胞菌感染耐药机制

致谢

攻读硕士期间发表的论文