树鼩RBP3蛋白T细胞抗原表位的预测及其致葡萄膜炎活性

摘要

研究背景与目的： 间质视黄醇结合蛋白(Retinol-binding Protein，RBP)，也称为光感受器间维生素A类结合蛋白（Interphotoreceptor Retinoid-binging Protein, IRBP）是主要由视网膜视杆细胞产生和分泌的一种糖蛋白，位于光感受器间基质，发挥转运和释放光感受器和视网膜色素上皮之间的维生素A类的作用。此外，IRBP还具有很强的抗原性和致葡萄膜炎活性。利用IRBP免疫诱导易感性实验动物建立的实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveoretinitis，EAU）模型，是研究人自身免疫性葡萄膜炎的主要工具。目前，大部分研究使用异源性的人和或牛的IRBP，如人IRBP1-20、IRBP651-670免疫C57BL/6小鼠；IRBP161-180免疫B10.RⅢ小鼠；人的R14(IRBP1169-1191)、R16(IRBP1177-1191)免疫Lewis大鼠，以及牛的IRBP抗原免疫诱导大鼠。 IRBP诱导EAU的机制并不完全清楚，但目前研究认为可能的机制是具有免疫优势的多肽片段与抗原提呈细胞上的主要组织相容性复合物（Major Histocompatibility Complex，MHC）有较强的亲和力，即 IRBP的免疫优势表位结合于抗原提呈细胞上的MHC分子的重要位点上，激活抗原提呈细胞，活化后的抗原提呈细胞可诱导Na?ve T细胞分化为效应性Th1细胞和Th17细胞，随后上述细胞通过产生如IFN-γ和IL-17等炎性细胞因子而引起疾病的发生。 近来，树鼩作为灵长类最亲密的近亲，在视觉系统，免疫系统等方面与灵长类具有高度的相似性，并且已成功利用树鼩建立近视、肝炎等疾病模型。并且研究表明，树鼩的MHC-Ⅱ类分子含有人类相应的MHC-Ⅱ类分子。全基因组测序研究报道了树鼩间质视黄醇结合蛋白RBP3(ELW66657.1)，但有关其蛋白的T细胞抗原表位以及是否具有潜在的致葡萄膜炎活性树鼩是否可建立EAU模型并未见报道。 基于以上背景，我们进行了以下三个方面的研究：（1）通过DNAMAN软件比对分析树鼩RBP3蛋白与人IRBP蛋白、狒狒IRBP，牛IRBP?大鼠IRBP和小鼠IRBP氨基酸序列的同源性；Protean软件预测树鼩RBP3蛋白的T细胞抗原表位；根据预测结果，筛选并合成与诱导经典B10.RⅢ小鼠EAU模型的IRBP161-180具有较高同源性的抗原多肽，并评价其免疫原性和致小鼠葡萄膜炎的活性，以期筛选出具有免疫原性和致萄膜炎活性的树鼩 RBP3蛋白抗原多肽；（2）将筛选出的树鼩RBP3182-192多肽片段免疫B10.RⅢ小鼠诱导EAU，与IRBP161-180诱导 B10RⅢ小鼠EAU比较，探讨筛选出的树鼩RBP3182-192抗原多肽诱导B10.RⅢ小鼠葡萄膜炎的发生条件、临床表现、病理组织学特征以及免疫表型特征，以期确定出树鼩 RBP3182-192诱导的 EAU模型特征；（3）筛选并合成与人R14抗原片段具有较高同源性的树鼩RBP31197-1211肽段和人 R14抗原片段免疫树鼩，初步探讨上述抗原诱导树鼩实验性自身免疫性葡萄膜炎模型发生的条件、临床表现以及病理特征。通过上述研究，以期为建立新型的EAU模型提供基础的理论依据，以及为葡萄膜炎的研究提供一种理想的动物模型。 第一部分：树鼩RBP3蛋白T细胞抗原表位的预测及其致葡萄膜炎的活性 方法： 采用 DNAMAN软件比对分析树鼩 RBP3蛋白氨基酸序列与人IRBP、狒狒IRBP、牛IRBP、大鼠IRBP以及小鼠IRBP蛋白氨基酸序列的同源性。利用Protean软件预测并分析树鼩RBP3蛋白的Th细胞抗原优势表位，以及与鼠MHC-Ⅱ类分子相互作用的T细胞抗原位点。根据预测结果合成RBP3182-192肽段，并以100μg RBP3182-192多肽与弗氏完全佐剂(Complete Freund's Adjuvant，CFA)充分乳化的PBS溶液200μl通过皮下注射于B10.RⅢ小鼠，按照相同的方法用200μl CFA-PBS溶液免疫B10.RⅢ小鼠作为正常对照组。应用裂隙灯显微镜和H&E染色法评价小鼠眼部炎症的临床表现和病理组织学变化，以期评价 RBP3182-192多肽致小鼠的葡萄膜炎活性。应用MTT法检测RBP3182-192多肽对炎症高峰期脾脏淋巴细胞的诱导增殖情况，以期评价筛选出的RBP3182-192多肽的免疫原性。 结果： Blast结果显示，树鼩RBP3与人的IRBP同源性最高（83.50%），然后按大鼠IRBP（82.94%）、狒狒IRBP（82.81%）、小鼠IRBP（82.63%）、牛IRBP（82.23%）依次递减。预测分析结果显示，树鼩RBP3蛋白含有47个Th细胞抗原优势表位，约占整个氨基序列的44%，同时也具有34个与鼠MHC-Ⅱ类分子I区免疫相关抗原结合位点，约占整个氨基酸序列的19%。B10.RⅢ小鼠在免疫10天后开始产生炎症，13天炎症达到高峰，通过裂隙灯显微镜观察发现，小鼠角膜浑浊、睫状充血、虹膜异常色素沉着、前房积脓、瞳孔不规则和缺损。病理组织HE染色结果发现显示眼组织呈现全葡萄膜炎，眼前段和眼后段大量炎性细胞浸润、视网膜结构紊乱折叠、视网膜内可见肉芽肿形成，视网膜下腔广泛纤维素渗出。正常对照组未见炎症。同时 RBP3182-192肽段显著诱导炎症高峰期小鼠的脾脏淋巴细胞增殖。 结论： 树鼩RBP3蛋白存在较多Th细胞抗原优势表位以及CD4+T抗原表位，预测并筛选出的 RBP3182-192多肽具有诱导 T细胞增殖的免疫原性和致小鼠葡萄膜炎疾病的活性，可为 RBP3蛋白的应用以及建立新型的EAU模型提供理论依据。 第二部分：树鼩RBP3182-192诱导B10.RⅢ小鼠EAU模型的特征 方法： 包含50μg的树鼩RBP3182-192或人的IRBP161-180肽段的CFA乳化物PBS溶液200μl通过皮下注射免疫诱导B10.RⅢ小鼠，分别为TS-EAU组和HU-EAU组，HU-EAU组作为阳性对照，200μl的CFA-PBS乳液皮下注射于B10.RⅢ小鼠作为正常对照组。应用裂隙灯显微镜和H&E方法评价小鼠眼部的炎症开始、发展及消退过程的临床表现和病理组织学变化；建立EAU模型后在炎症开始、高峰期及消退期，分别提取分离脾脏组织RNA，利用q-PCR检测T-bet和RORγt的mRNA表达水平；建立EAU模型后在炎症开始、高峰期及消退期，分离得到的血清，通过ELISA法检测IFN-γ和IL-17的含量；建立EAU模型后分别在炎症高峰期，通过MTT细胞试剂盒检测淋巴细胞的增殖。 结果： TS-EAU组的在免疫诱导后的第10d炎症开始，与HU-EAU组（7d）相比晚3d，并在第13d炎症达到高峰期，之后炎症逐渐减轻，46d仍有轻微炎症；临床表现和组织病理学改变基本相同，临床表现主要为小鼠角膜浑浊、睫状充血、虹膜异常色素沉着、前房积脓、瞳孔不规则和缺损。组织病理学改变主要为视网膜和脉络膜炎性细胞的浸润、视网膜结构折叠紊乱、视网膜内可见肉芽肿形成，视网膜下腔广泛纤维素的渗出。正常对照组未见炎症。q-PCR结果显示，HU-EAU组的RORγt在炎症开始阶段表达最高，随后降低，T-bet在炎症高峰期表达最高，而TS-EAU组的RORγt和T-bet均在炎症高峰期的时候表达最高，在炎症开始阶段表达较低。ELISA结果显示，HU-EAU组的IL-17在炎症开始阶段表达最高，随后降低，IFN-γ在炎症高峰期表达最高，而TS-EAU组的IL-17和IFN-γ均在炎症高峰期的时候表达最高，在炎症开始阶段表达较低。T细胞增殖实验结果显示， RBP3182-192和IRBP161-180抗原均使淋巴细胞明显增殖。 结论： 树鼩RBP3182-192多肽免疫诱导的B10.RⅢ小鼠TS-EAU模型在临床表现和病理组织学变化方面与 IRBP161-180免疫诱导的 B10.RⅢ小鼠HU-EAU模型具有相同的特点，同时在免疫机制上具有自身的特点，可作为研究葡萄膜炎的一种新EAU模型。 第三部分：树鼩EAU模型的初步建立 方法： 分别将包含300μg的人 R14肽段和包含前期预测分析并合成的300μg的树鼩 RBP31197-1211多肽的 PBS溶液与包含补充2.5mg/ml的H37Ra结核杆菌的CFA按照1：1乳化，共200μl，通过皮下注射免疫诱导树鼩，同时腹腔注射PTX500ng，分别为A组和B组，将200μl的CFA-PBS溶液乳化后按照上述方式免疫树鼩及腹腔注射PTX500ng作为正常对照组。应用裂隙灯显微镜和眼底镜观察树鼩眼部的炎症变化。 结果： 裂隙灯显微镜观察结果显示，A组在免疫诱导30天后炎症开始出现，表现为局部轻微的角膜混浊、巩膜脱色素，在5个月时表现为巩膜脱色素；B组免疫树鼩20天左右出现局部轻微的角膜混浊、巩膜脱色素。眼底镜观察结果显示，A组免疫树鼩5个月后，表现局部血管炎渗出；B组免疫树鼩30天未见明显炎症；组织病理学显示A组视网膜各层增厚，视网膜层有炎症细胞的浸润，视网膜色素层、光感受器细胞层、神经节细胞层均折叠歪曲、视网膜下腔纤维素渗出，色素上皮细胞脱落。B组的视网膜各层增厚。正常对照组未见炎症。 结论： 利用人R14抗原片段和树鼩RBP31197-1211多肽片段免疫诱导树鼩，均可建立树鼩EAU模型，但尚需进一步研究探讨诱导树鼩EAU模型的最佳条件。应用示范研究后，可望为葡萄膜炎研究提供新的EAU模型。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 树鼩RBP3蛋白T细胞抗原表位的预测及其致葡萄膜炎的活性

1材料与方法

2.结果

3.讨论

第二部分 树鼩RBP3182-192诱导B10.RⅢ小鼠EAU模型的特征

1.材料和方法

2.结果

第三部分 树鼩EAU模型的初步建立

1.材料和方法

2 结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:实验性自身免疫性葡萄膜炎动物模型的研究

致谢

攻读硕士期间论文发表情况