MicroRNA-20a-5p通过调控OSM和CCL1抑制VKH患者CD4+T细胞IL-17的表达

摘要

背景和目的： 葡萄膜炎是常见的致盲率高的自身免疫性眼病。在我国，Vogt-小柳原田综合征（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome,VKH)是常见的一种葡萄膜炎类型。但该综合征的发病和进展机制仍不十分清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一类小的、非编码RNA，通过碱基互补配对结合在编码基因mRNA的3’UTR区（untranslated region,UTR)参与基因转录后表达调控。研究显示MicroRNA-20a-5p(miR-20a-5p)参与调控多发性硬化疾病的发病和进展，暗示了miR-20a-5p参与自身免疫性疾病进程的调控。因此，我们想探索miR-20a-5p是否参与调控Vogt-小柳原田综合征的发病和进展。 本研究拟探讨miR-20a-5p在Vogt-小柳原田综合征中的作用及机制。旨在Vogt-小柳原田综合征中揭示一个新的关于miRNA的调控信号通路，为理解疾病的发生发展提供新的思路。 方法： 1.分别抽取活动期Vogt-小柳原田综合征患者和正常人的外周静脉血，并分离他们的CD4+T细胞；利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测两组人群CD4+T细胞中miR-20a-5p的表达水平； 2.利用亚硫酸盐测序法（BSP)检测活动期Vogt-小柳原田综合征患者和正常人CD4+T细胞中miR-20a-5p启动子CpG岛甲基化状态； 3.利用miRNAsIE基因数据库OmicsBean预测miR-20a-5p的基因；利用双荧光素酶实验验证miR-20a-5p对候选靶基因mRNA3’UTR的抑制作用；利用免疫印迹技术（Western Blot)检测miR-20a-5p对靶基因蛋白表达的抑制作用； 4.利用流式细胞术（FCM)和酶联免疫吸附实验（ELISA)分别检测体外转染miR-20a-5p mimics，miR-20a-5p inhibitor及共转miR-20a-5p/OSM或miR-20a-5p/CCLl后，活动期Vogt-小柳原田综合征患者的CD4+T细胞Thl7和Thl的细胞比例以及分泌的细胞因子IL-17和IFN-γ的水平； 5.利用Western Blot检测不同处理组CD4+T细胞中PI3K-AKT信号通路主要蛋白的表达情况。 结果： 1.qRT-PCR结果显示：与正常人相比，活动期Vogt-小柳原田综合征患者的CD4+T细胞中miR-20a-5p表达明显降低。FCM结果显示:miR-20a-5p mimics可减少Thl7细胞比例，而miR-20a-5pinhibitor显示了相反的作用。ELISA结果显示：miR-20a-5p mimics抑制CD4+T细胞中IL-17的表达，反之亦然。 2.BSP测序结果显示：与正常人相比，活动期Vogt-小柳原田综合征患者的miR-20a-5p启动子区域CpG岛甲基化比率较高，而甲基化抑制剂（5-Aza-2’-deoxycytidin)处理患者CD4+T细胞后，甲基化比率下降；一致地，qRT-PCR结果显示5-Aza-2’-deoxycytidin处理患者CD4+T细胞后miR-20a-5p表达回升。 3.OmicsBean软件预测出OSM，CCL1及SEMA7A为miR-20a-5p的靶基因；双荧光素酶实验结果显示过表达miR-20a-5p显著抑制293T细胞中OSM和CCL1的3’UTR区荧光素酶活性；一致地，过表达miR-20a-5p可抑制患者CD4+T细胞中OSM和CCL1蛋白表达。 4.转染了miR-20a-5pmimics后的CD4+T细胞Thl7细胞比例和IL-17分泌显著减少，而转染了miR-20a-5pinhibitor后的CD4+T细胞Thl7细胞比例和IL-17分泌显著增多。重要的是，过表达miR-20a-5p导致CD4+T细胞Thl7细胞比例和IL-17分泌减少的作用可被OSM和CCL1的重新表达所逆转。 5.WesternBlot显示过表达miR-20a-5p显著增加CD4+T细胞中磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达，而沉默miR-20a-5p显示了相反的作用。重要的是，OSM和miR-20a-5p共转染后，miR-20a-5p过表达导致p-PI3K和p-AKT蛋白增加的作用被减弱。此外，沉默miR-20a-5p导致p-PI3K和p-AKT蛋白减少的作用可被PI3K-AKT信号通路抑制剂（LY294002)的加入所逆转。 结论： 我们发现在活动期Vogt-小柳原田综合征患者的CD4+T细胞中miR-20a-5p的表达明显降低，降低的miR-20a-5p水平是由于其启动子区域髙甲基化造成的。我们揭示了miR-20a-5p可抑制CD4+T细胞Thl7的细胞比例和IL-17的分泌。重要的是，miR-20a-5p的这种作用是通过抑制OSM和CCL1来实现的。此外，我们还发现miR-20a-5p可以抑制PI3K-AKT信号通路活性从而抑制CD4+T细胞IL-17的产生。

目录

声明

英汉缩略语名饲对照

前言

第一章在VOGT-小柳原田综合征患者中低表达的MIR-20A-5P增加了 IL-17 的含量

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章活动期VKH患者CD4+T细胞中MIR-20A-5P的低表达与其启动子区域高甲基化有关

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章MIR-20A-5P靶基因及其信号通路探讨

第一节MIR-20A-5P靶基因预测

第二节OSM、CCL1及SEMA7A3’ UTR双荧光素酶活性检测

第三节MIR-20A-5P通过靶向抑制OSM和CCL1抑制CD4+T细胞IL-17产生

第 四 节 MIR-20A-5P参与调控PI3K-AKT信号通路

参考文献

文献综述:microRNA通过固有免疫细胞对自身免疫疾病的调控

致谢

攻读学位期间研究成果