向日葵离体再生及农杆菌介导的遗传转化研究

摘要

本研究以紫苏为材料，利用RT-PCR及常规PCR从紫苏种子中分别克隆得到紫苏ω-3脂肪酸脱氢酶基因fad3及fad7的cDNA全长序列，并利用克隆得到的目的基因构建了植物表达载体。在此基础上，以向日葵常规品种大清花为试验材料，进行了向日葵离体再生及遗传转化研究，主要研究结果如下：
　　1、对目的基因序列的相关序列分析表明，目的基因序列与紫苏及其他植物的ω-3脂肪酸脱氢酶基因序列具有较高的相似度（﹥80%）。同时，利用克隆得到的目的基因，以pCAMBIA1301质粒为载体成功构建了pCAMBIA1301-fad3和pCAMBIA1301-fad7植物表达载体，并成功转化农杆菌GV3101。
　　2、通过探讨不同浓度的不同植物激素及不同处理方式等对向日葵子叶愈伤组织诱导、无菌苗/芽茎段生长及其根诱导、子叶节芽诱导及其根诱导的影响，进一步优化了向日葵子叶愈伤组织诱导方法，成功建立了向日葵无菌苗/芽茎段培养体系和向日葵子叶节高效离体再生体系。结果表明，向日葵子叶愈伤组织诱导最佳培养基为MS+0.1或0.2 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT+1.0或2.0 mg·L-16-BA，此条件下子叶愈伤组织诱导率最高可达97.8%，而愈伤组织的褐化率则较低，仅为17.5%；向日葵无菌苗/芽茎段生长最适培养基为MS+2.0 mg·L-16-BA；向日葵子叶节芽诱导最适培养基为MS+0.05 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 KT，子叶节处理方式为不纵切，此条件下子叶节芽诱导率及芽的平均高度分别高达93.1%和3.5 cm；向日葵无菌苗/芽茎段及子叶节再生苗最适根诱导培养基为MS+0.1-0.2 mg·L-1 NAA，此条件下向日葵无菌苗茎段的生根率、平均得根数、平均根系长度分别达到93.3%、5.3根和8.3 cm；向日葵无菌芽茎段的生根率、平均得根数及平均根系长度分别为95.6%、7.5根和9.8 cm；子叶节再生苗的生根率、平均得根数及平均根系长度分别为90.8%、5.4根和8.3 cm。将生根完好的再生苗炼苗后进行移载，移栽成活率为71.9%。
　　3、利用已构建的植物表达载体pCAMBIA1301-fad3及pCAMBIA1301-fad7，通过农杆菌介导法（农杆菌菌株为GV3101），对向日葵常规品种大清花无菌苗茎段进行遗传转化研究，初步建立了无菌苗茎段遗传转化体系。其最佳转化条件为，农杆菌侵染液浓度：OD600=0.6-0.8，侵染时间：10 min，共培养温度：26℃，共培养时间：黑暗条件下共培养3天，共培养基：MS+2.0 mg·L-16-BA+150μmol·L-1 AS，筛选培养基：MS+2.0 mg·L-16-BA+50 mg·L-1 Kan+500 mg·L-1 Cef，伸长培养基：MS+2.0 mg·L-16-BA+250 mg·L-1 Cef，生根培养基：MS+0.2 mg·L-1 NAA+250 mg·L-1 Cef，抗性植株种子的筛选培养基：MS+350 mg·L-1 Kan。
　　4、向日葵抗性植株生根条件的优化：将经过 Kan筛选的向日葵抗性植株基部切去1.0 cm左右小段后转入伸长培养基中培养15天；将伸长培养后的向日葵抗性植株基部再切去1.0-2.0 cm左右小段后转入生根培养基进行根诱导。

目录

1 引言

1.1 向日葵离体再生及转基因研究

1.2 多不饱和脂肪酸

1.3 研究目的及意义

2 紫苏ω-3 FAD基因的克隆及其表达载体的构建

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

3 向日葵离体再生研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

4 农杆菌介导的向日葵遗传转化体系的建立

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

5 结论

5.1 紫苏ω-3 FAD基因的克隆及其表达载体的构建

5.2 向日葵离体再生研究

5.3 向日葵遗传转化体系的建立

参考文献

附录A：作者攻读硕士学位期间发表论文及科研情况

附录B：MS培养基母液配制

附录C：缩略词表

致谢

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