寮刁竹(Cynanchum paniculatum)甲醇提取物的分离纯化鉴定及其对尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒的中和作用研究

摘要

蛇毒是由蛋白质、酶、多肽及其小分子等组成的复杂混合物，其中蛋白质（酶、多肽）占90％以上，其生物学活性和药理学活性十分多样。受害者被毒蛇咬伤后，蛇毒从伤口渗入体内组织和器官，其各种毒素成分单独或协同地行使不同的生物学功能，最终导致受害者正常的生理生化活动紊乱。患者呈现软瘫、出血与凝血障碍、水肿、肌肉坏死和局部组织溃烂等症状，也有患者出现眼睑下垂、呼吸急促等症状。
　　目前，抗蛇毒血清治疗蛇伤被肯定是最有效的直接治疗手段。但抗蛇毒血清存在很多不足，血清中的杂蛋白会引起副作用，如过敏反应、血清病及一些并发症等，另外生产周期长、成本高、产率低且不易保存。因此，人们希望寻找到新的高产量、低成本且安全性好的抗毒剂来治疗蛇伤。在国内外蛇伤发生地区（如亚洲、非洲和南美洲等），常用草药急救蛇伤患者，于是人们将视野瞄准这些草药活性物质，尤其是那些天然的抑制剂和药效活性化合物。
　　本文选用我国中医治疗蛇伤时常用的九味药材即旱莲草(Eclipta prostrata)、姜黄(Curcuma longa L.)、鱼腥草(Houttuynia cordata T.)、穿心莲(Andrographis paniculata N.)、通城虎(Aristolochia fordiana H.)、七叶一枝花(Paris polyphylla)、四块瓦(Lysimachia paridiformis)、柠檬(lemon B.)和寮刁竹(Cynanchum paniculatum)作抗蛇毒活性实验的比较研究，大量实验表明，寮刁竹具有最好的抗蛇毒活性。然后以寮刁竹为重点研究对象，开展了从寮刁竹中提取、分离、纯化活性成分以及设计了中和尖吻蝮蛇毒的系列活性实验工作。
　　首先，采用75%甲醇抽提寮刁竹，得到该甲醇粗提物，并对其进行活性实验测定，结果表明：①寮刁竹甲醇粗提物对尖吻蝮蛇毒中的凝脂酶A2（PLA2）、纤溶酶、透明质酸酶的中和作用效果好，并呈量效关系。② SDS-PAGE实验进一步证明寮刁竹甲醇粗提物可以中和尖吻蝮蛇毒中纤溶酶的活性，且呈量效关系。③寮刁竹甲醇粗提物可缓减尖吻蝮蛇毒引起的小鼠背部出血和脚的水肿症状，治疗效果呈量效关系。④寮刁竹甲醇粗提物本身不具有溶血性。
　　其次，将寮刁竹甲醇粗提物通过有机溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇）依次分级萃取，再用Sephadex LH-20凝胶层析进行分离，得到三个主要峰即C1、C2和C3，再经过中和尖吻蝮蛇毒中的纤溶酶活性实验，结果表明只有C2峰具有最强的中和作用，而C1和C3几乎没有作用。
　　最后，将C2峰用RP-HPLC进一步分离纯化，得到多个峰，我们选择含量较高的三个峰即P1、P2和P3，再经过中和尖吻蝮蛇毒中的纤溶酶活性实验，结果表明只有P2峰具有最强的中和作用，而P1和P3几乎没有作用。将P2峰经质谱和核磁共振检测，鉴定为丹皮酚原苷。将丹皮酚原苷进行活性实验测定，结果表明丹皮酚原苷可以显著地中和尖吻蝮蛇毒中透明质酸酶，同时动物实验表明，丹皮酚原苷也可缓减尖吻蝮蛇毒引起的小鼠背部出血和脚的水肿症状。
　　总之，本研究首次从中药材寮刁竹中获得抗尖吻蝮蛇毒的一个有效成分，并鉴定其是丹皮酚原苷类物质，从而揭示了寮刁竹治疗尖吻蝮蛇咬伤发挥作用的物质基础。