桑青枯菌快速检测靶标内切葡聚糖酶抗体的制备与检测

摘要

青枯病是通过土壤传播的一种细菌病害，引发该病害的是青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。青枯劳尔氏菌群体复杂，生理分化明显，不同菌株的寄主、地理分布、致病力、生化型、血清型等细菌学特征都有较大差异，桑青枯菌属于青枯劳尔氏菌分类中的生化分类Ⅲ型，分子分类Ⅰ型。桑青枯菌一旦侵染桑树，便会极速传播，给蚕桑业带来巨大的危害。如果能够检测到潜在的病原菌的存在，就可以预知青枯病暴发的可能性，尽可能早的采取措施降低或避免青枯病带来的损失。因此，建立一种能够在现场方便、快速检测桑青枯菌的方法就变得十分必要。
　　目前报道的检测桑青枯菌的方法因受到各种条件的限制，只适合在实验室中对采集到的样品中的桑青枯菌进行检测，并不适合在现场检测。胶体金免疫层析检测技术是目前快速检测病原菌的前沿技术之一，非常适合于现场使用。利用该项技术检测桑青枯病病原菌的关键步骤是筛选到合适的靶标蛋白。内切葡聚糖酶(EGL)是青枯劳尔氏菌在胞内合成后分泌、吸附于细胞壁周围的一个重要毒力因子，本研究通过制备抗EGL多克隆抗体探究以内切葡聚糖酶为靶标的桑青枯病快速检测诊断技术，为病害防控提供技术支持。主要研究结果如下：
　　一、桑青枯菌的分离鉴定及其内切葡聚糖酶的序列特异性分析
　　使用TZC鉴别培养基对桑青枯菌进行分离纯化培养，对分离到的菌株通过16S rDNA基因克隆测序，构建系统进化树，确定分离到的三株菌株都属于桑青枯菌。然后对桑青枯菌的 egl基因进行 T克隆并测序（GenBank登录号：KT750256）。将从青枯劳尔氏菌G12-50菌株克隆的egl基因编码蛋白质序列与土壤中常见细菌（大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、根瘤菌Rhizobium acidisoli、嗜热脂肪土芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus）的内切葡聚糖酶蛋白质序列进行比对，结果表明G12-50菌株的内切葡聚糖酶与土壤中常见细菌的内切葡聚糖酶的同源性较低(23％～28%)，未见3个以上氨基酸同源的片段。同时将G12-50菌株的内切葡聚糖酶与植物常见的病原细菌（假单胞菌Pseudomonas sp. Chol1、根癌土壤杆菌Erwinia rhapontici、欧文氏杆菌Agrobacterium tumefaciens、斯氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri）的内切葡聚糖酶进行氨基酸序列比对，比对结果也表明G12-50菌株的内切葡聚糖酶与植物常见病原细菌内切葡聚糖酶的同源性较低(22%～29%)，也未见3个以上氨基酸同源的片段。并对这些细菌的内切葡聚糖酶进行表面抗原决定簇的预测，预测结果表明土壤及植物常见病原细菌内切葡聚糖酶与桑青枯菌内切葡聚糖酶没有相同的表面抗原决定簇。这些分析结果确定了内切葡聚糖酶作为桑青枯菌检测的靶标蛋白的可能性。
　　二、桑青枯菌内切葡聚糖酶的原核表达及抗体制备
　　对选定的靶标蛋白内切葡聚糖酶基因进行亚克隆，将阳性克隆的目的片段与表达载体pET32a分别用EcoR I和Sal I进行双酶切，连接后导入到大肠杆菌感受态细胞中得到重组质粒pET32a-EGL。将重组质粒转化至E.coli BL21中诱导表达，得到的重组EGL蛋白过His Trap HP组氨酸标记的亲和层析柱进行纯化。纯化的EGL作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体。制备的抗EGL多克隆抗体经ELISA测定，其效价达1∶20000，Western blot分析亦呈现单一的特异性条带。说明制备的抗EGL多克隆抗体效价高，能够特异地检测桑青枯菌内切葡聚糖酶。
　　三、桑青枯菌内切葡聚糖酶抗体的检测应用初步分析
　　用制备的抗体对培养的桑青枯菌G12-50菌液进行活菌的Western blot检测，结果出现明显的特异性条带，而对照大肠杆菌则没有出现条带。说明制备的多克隆抗体可以用于检测对桑树有致病性的青枯劳尔氏菌活菌，而且可以直接取桑茎汁液检测，不用破裂细胞提取蛋白质，从而使检测更加方便、快速，更具有实用价值。对桑园采集的土壤样品进行细菌的分离培养，分离到的单菌落经Western blot检测都没有条带出现，只有阳性对照桑青枯菌出现特异性条带。实际土壤样品的检测说明青枯劳尔氏菌的内切葡聚糖酶比较特异，可以区别于其他土壤微生物，能应用于桑园土壤样品中检测青枯劳尔氏菌。这些研究结果都表明，桑青枯菌内切葡聚糖酶可以作为桑青枯病早期检测诊断的病原靶标，直接应用于对桑园土壤和桑树样品的快速检测。
　　本项研究结果为快速检测技术如胶体金免疫层析试纸条等在桑青枯病病原菌检测中的应用奠定了试验基础。