中华按蚊化感组织的转录组测序及化感基因的表达谱分析

摘要

蚊虫不仅叮咬骚扰人，还传播多种疾病，如疟疾、登革热、丝虫病、寨卡热和乙型脑炎等。其中，疟疾是危害最严重的蚊媒病，主要由按蚊Anopheles传播，中华按蚊是中国疟疾传播的主要媒介，而且单一以中华按蚊为媒介的疟区呈上升态势，因此阻断中华按蚊对疟疾的传播是控制我国疟疾传播的关键。蚊虫主要通过宿主释放的气味、CO2，以及周围环境的化学信号等线索来追寻宿主、选择配偶和寻找产卵场所，这些化学线索主要依靠化学感受系统感知化学信号。触角、喙和下颚须是蚊虫化学感受系统的重要组成部分，在其上分布着各种不同形态的化学感受器。在化学感受器内部又分布着许多感受气味分子的蛋白因子，蚊虫通过这些因子的相互作用，共同完成化学物质的感受和信号的传递，进而产生行为反应。因而探究蚊虫化学感受系统的分子机制变得尤为重要。迄今为止，冈比亚按蚊、白纹伊蚊、南方库蚊、四斑按蚊和库态按蚊等蚊虫的触角和下颚须等组织已完成转录组测序，采用生物信息学方法鉴定出大量分布于嗅觉器官中的化学感受基因，其中冈比亚按蚊分析最为完善。但有关中华按蚊化学感受基因在不同嗅觉组织间的差异表达尚无报道。本研究利用转录组测序技术分析中华按蚊雌/雄触角、喙、下颚须中化学感受基因的表达谱，以期发现中华按蚊化学感受系统的关键基因，从而为今后研究中华按蚊以化学感受为基础的行为调控机制奠定基础。主要研究结果如下： ①各组织中表达的化学感受基因数量 共注释出109个表达的化学感受基因，其中雌蚊触角（FA）、喙(FP)、下颚须(FM)、整只蚊虫(以下简写为整蚊，FB)表达的化学感受基因数量分别是78、58、41和34；雄蚊触角（MA）、喙(MP)、下颚须(MM)、整蚊(MB)表达的化学感受基因数量分别是79、55、27和34个。雌、雄蚊的触角、喙和整蚊中鉴定出的化学感受基因数量差异很小，但雌蚊下颚须中的化学感受基因数量显著多于雄蚊下颚须。 ②化学感受基因的表达谱 中华按蚊化学感受基因呈现明显的组织特异性或偏好性表达模式。在化学感受组织中特异性富集表达的化感基因有67个，在化感组织和非化感组织中广谱性表达的基因有14个。雌蚊偏好性表达的化感基因有43个，雄蚊偏好性表达的化感基因有21个。触角特有化学感受基因31个，分别是AsOBP62、AsOR1、AsOR22、AsOR30等；喙中特有化学感受基因9个，分别是AsOR4、AsGR6、AsGR7、AsIR7x、AsGR26、AsGR36、AsGR60、AsGR63和AsGR71；下颚须特有化学感受基因5个，分别是AsOBP58、AsOR8、AsOR28、AsGR1和AsGR30。表达水平较高的化感基因只在触角筛选到（FPKM值＞15），其中雌蚊触角有7个，分别是AsOBP1、AsOBP2、AsOBP4、AsOBP7、AsOBP20b、AsOBP72和AsOR11；雄蚊触角只有AsOBP2高水平表达。触角、喙和下颚须三个嗅觉组织比较，雌蚊中，触角中差异表达的化感基因最多；雄蚊中，喙中差异表达的基因最多。触角是中华按蚊感知外界信息的重要器官，GO注释分析发现，雌蚊触角偏好性表达基因的功能主要富集在嗅觉感知，雄蚊触角偏好性表达基因的功能主要富集在味觉感知，同时雄蚊触角中可能有一种或几种蛋白等量替代了气味结合蛋白在运载气味分子中的功能。 ③特异表达的化学感受基因的功能推测 通过表达谱研究，并与其他蚊虫进行比较分析，推测了部分特异性表达的化感基因的功能，比如：AsOR1、AsOBP1、AsOBP2、AsOBP4、AsOBP7、AsOBP20b、AsOBP72和AsOR11等可能在雌蚊追寻、识别宿主过程具有重要作用，AsOBP1和AsOBP4可能在找寻产卵场所中具有重要作用，AsOBP33和AsOBP42具有非嗅觉功能，AsOR37、AsOR40、AsOR52、AsOR58可能在幼虫中具有特定的功能，AsGR58、AsGR46和AsGR3等基因可能与感知气流运动有关。但这些基因的确切功能需要通过实验进一步验证。

目录

1 绪 论

1.1 研究背景

1.1.1 中华按蚊的危害及其防治

1.1.2 昆虫的嗅觉感受机制

1.1.3基于转录组的蚊虫化感基因表达谱研究现状

1.2研究目的与意义

1.3研究主要内容

1.3.1 中华按蚊触角、喙、下颚须和整蚊转录组的测序、组装和拼接

1.3.2 中华按蚊触角、喙、下颚须和整蚊之间基因的差异表达分析

1.3.3 中华按蚊触角、喙、下颚须和整蚊之间的化感基因差异分析

1.3.4 用qPCR对中华按蚊进行组织表达验证

1.4 技术路线

2 中华按蚊化感组织转录组的测序及质量评估

2.1实验材料

2.1.1 供试蚊虫

2.1.2 实验试剂及设备

2.2实验方法

2.2.1取样方法

2.2.2 总RNA的提取及质量检测

2.2.3 cDNA文库的构建与高通量测序

2.2.4 转录本的拼接与组装

2.2.5 基因表达水平的定量

2.2.6 RNA-seq整体质量评估

2.3结果与分析

2.3.1 取样情况

2.3.2 总RNA提取及质量检测

2.3.3 中华按蚊测序数据产量的统计及质量控制

2.3.4 参考序列比对分析

2.3.5 基因表达水平的定量

2.3.6 RNA-Seq整体质量评估

2.4 总结与讨论

3 中华按蚊化感组织基因的差异表达分析

3.1 实验材料

3.1.1 实验数据

3.1.2 实验软件

3.2 实验方法

3.2.1 差异表达分析

3.2.2 差异基因GO富集分析

3.2.3 差异基因KEGG富集分析

3.3 结果与分析

3.3.1 差异基因的筛选结果

3.3.2 差异基因表达情况

3.3.3 差异基因的聚类分析

3.3.4 差异基因GO富集分析

3.3.5 差异基因KEGG富集分析

3.4 总结与讨论

4 中华按蚊化学感受基因的注释和表达谱分析

4.1 材料与方法

4.1.1 中华按蚊化学感受基因的信息

4.1.2 转录组中化学感受相关基因的注释

4.1.3 转录组中化学感受相关基因的差异表达分析

4.2 结果与分析

4.2.1 化感基因的注释结果

4.2.2 化感基因的表达水平分析

4.2.3 筛选差异化感基因

4.2.4 差异化感基因的表达丰度分析

4.2.5 差异化感基因的GO注释

4.3 总结与讨论

5 中华按蚊嗅觉器官化感基因的组织表达验证

5.1 材料与方法

5.1.1 中华按蚊及中华按蚊组织收集

5.1.2 主要试剂及仪器设备

5.1.3 中华按蚊触角、喙、下颚须和整蚊总RNA的提取

5.1.4 中华按蚊触角、喙、下颚须和整蚊cDNA第一链的合成

5.1.5 引物设计

5.1.6 PCR反应体系及反应程序

5.2 结果与分析

5.2.1 中华按蚊化学感受相关基因的组织表达量分析

5.3讨论

6 结论

参考文献

附录A:攻读硕士学位期间发表论文及科研情况

附录B:测序错误率分布图

附录C:GC含量分布图

附录D:原始数据组成

附录E:不同性别之间的差异基因

附录F:注释结果

附录G:不同性别之间的差异化感基因

致谢

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