聚（DL—乳酸）的改性及体外降解和细胞相容性研究

摘要

本文从优化聚(DL-乳酸)(PDLLA)的制备工艺，制备超高分子量PDLLA入手，用马来酸酐(MAH)、乙二胺和I型胶原对PDLLA进行整体(而不是表面)化学改性，制得了一系列改性聚乳酸，旨在开发一种基于超高分子量PDLLA的降解产物不呈酸性、降解速率可调、具有优良细胞相容性和生物特异性的生物医用材料，尽可能多地满足人体的需求。用化学分析、FTIR、1H-NMR、13C-NMR和荧光标记表征了它们的化学结构，用DSC表征了它们的热学性能，用Instron1011万能材料试验机测试了它们的力学性能，并考查了其亲疏水性、体外生物降解和细胞相容性。主要研究内容和结论如下： (1)以DL-丙交酯为原料，辛酸亚锡为引发剂，采用熔融开环聚合方法制备PDLLA，考查了DL-丙交酯的纯度、聚合时间、聚合温度和引发剂(辛酸亚锡)用量等因素对PDLLA分子量的影响，优化出了一套制备超高分子量PDLLA(粘均分子量高达220万)的制备工艺，并测试了超高分子量PDLLA的脆化温度、拉抻(压缩)强度和模量。结果表明： ①丙交酯的纯度是影响PDLLA分子量的一个重要因素，高纯丙交酯是制备高分子量PDLLA的必备条件；以纯度＞99.8％、熔点为126.3-126.4℃的DL-丙交酯为原料，在160℃下聚合36h，可制得粘均分子量高达220万的超高分子量PDLLA。 ②超高分子量PDLLA相对于低分子量PDLLA(粘均分子量为80万)，其拉伸(压缩)强度和模量、韧性及延展性都已大大提高，表现为韧性断裂，而低分子量PDLLA表现为脆性断裂，从而使超高分子量PDLLA可望在各医学领域如作为骨螺钉、手术缝合线、组织工程支架材料和通用完全可降解塑料方面得到广泛的应用。 (2)采用溶液混合、自由基聚合技术将MAH共价接枝到PDLLA骨架上，制得马来酸酐改性PDLLA(MPLA)，旨在向PDLLA中引入高反应活性的酸酐键，为进一步化学改性奠定化学基础。 ①FTIR、13C-NMR和DSC分析结果表明，MAH已成功地共价接枝到PDLLA骨架上；MPLA只有一个玻璃化转移峰值温度41.7℃，且低于PDLLA的玻璃化转移峰值温度56.5℃，提示MAH已对PDLLA成功改性，且采用本研究所述之分离提纯技术可得到纯净的MPLA。 ②化学滴定分析结果表明，MAH投料量为PDLLA质量的5％和10％时，MAH接枝率分别为1.86％和2.36％。 (3)用乙二胺对MPLA进行化学改性制得二胺改性PDLLA(DMPLA)，旨在通过碱性二胺的共价引入克服PDLLA和MPLA降解产物的酸性，改变PDLLA和MPLA的酸致自催化降解特点，开发出一种降解产物不呈酸性且具有良好亲水性的生物医用材料DMPLA，且DMPLA中的反应活性基团-COOH和-NH2为进一步引入胶原和多肽等生物活性分子，制备具有生物特异性和全面生理功能的生物医用材料奠定了化学基础。通过MPLA中高反应活性酸酐键的N-酰化开环将乙二胺共价引入到MPLA中，建立了一套二胺改性MPLA的改性技术。 ①化学滴定分析结果表明，MPLA中的酸酐键能完全与二胺反应；②FTIR、13C-NMR、1H-NMR和DSC分析结果表明，二胺已被成功地共价引入到MPLA中；DMPLA的玻璃化转移峰值温度为59.5℃，高于PDLLA和MPLA的玻璃化转移峰值温度，可能是DMPLA中的伯胺与羧基形成内盐所致；唯一的玻璃化转移温度提示，按本研究所述之分离技术能得到纯净的DMPLA。 (4)以二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂用Ⅰ型胶原对DMPLA进行整体(而不是表面)化学改性制得了胶原改性聚乳酸(CPLA)，旨在开发一种降解产物不呈酸性且具有良好生物相容性、生物特异性的生物医用材料，并建立一套适用于多肽或蛋白质对DMPLA进行整体化学改性的制备工艺，为制备具有全面生理功能的组织材料奠定技术基础。异硫氰酸荧光素(FITC)标记测定结果表明，采用本研究所述之制备和提纯工艺能成功地将Ⅰ型胶原共价引入到DMPLA整体中获得纯净的CPLA。 (5)用吸水率和静态水接触角表征了PDLLA、MPLA、DMPLA和CPLA的亲疏水性。结果表明，DMPLA和CPLA的亲水性相对于PDLLA已大大提高，CPLA具有最好的亲水性，DMPLA略次之，提示DMPLA和CPLA都可望成为一种具有良好亲水性和细胞亲和性的生物医用材料。 (6)考查了PDLLA、MPLA、DMPLA在降解过程中的pH值变化(介质pH=6.45蒸馏水，温度37.0±0.5℃)以及分子量和失重率变化(介质：0.1MPBS溶液，pH=7.4；温度37.0±0.5℃)。在整个降解实验中始终不更换介质。结果表明： ①MPLA在降解过程酸性增加最快，酸致自催化程度最大，由此而引起的降解速率最快，失重率也最大，比PDLLA呈现更严重的整体溶蚀降解，即体型降解特点。因此，尽管MPLA在水解后其亲水性已较PDLLA有较大改善，但仍不适于单独用作生物医用材料。 ②DMPLA已基本克服了降解过程中的酸性增强；其降解速率较PDLLA和MPLA均匀，不呈现PDLLA和MPLA的体型降解特征，且随二胺含量的增加，其降解速率逐渐减小；尽管DMPLA在前6周的失重率略高于PDLLA和MPLA，但经12周降解，其失重率不到50％，低于PDLLA和MPLA，且随二胺含量增加，失重也减少。上述结果提示，DMPLA是一种降解产物不呈现酸性、降解速率可调且降解过程不呈现体型降解特征的生物材料。 (7)采用细胞形态学观察法和细胞增殖法，以玻璃为对照，初步考查了PDLLA和DMPLA与成骨细胞的细胞相容性。用相差显微镜观察细胞形态和生长情况；用MTT法分别于1、2、4、6天对细胞记数，绘制生长曲线图。结果表明，成骨细胞在DMPLA上的形态、铺展和细胞密度都明显优于PDLLA和对照组；在DMPLA上的增殖速率最快，提示成骨细胞与DMPLA间具有明显优于与PDLLA和玻璃的细胞相容性，DMPLA是一种具有良好细胞相容性的生物医学材料，可望在生物医学领域尤其是组织工程领域中具有广泛的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

1绪论

1.1问题的提出与研究意义

1.2本文研究的目的和研究的内容

2超高分子量PDLLA的制备

2.1前言

2.2丙交酯的纯化

2.2.1实验试剂

2.2.2实验器材

2.2.3 D,L-丙交酯的纯化

2.3 D,L-丙交酯纯度的测定

2.3.1熔点法

2.3.2化学滴定法

2.4 PDLLA的合成与精制

2.4.1丙交酯制备PDLLA的合成原理

2.4.2实验试剂

2.4.3实验仪器

2.4.4 PDLLA的合成与纯化

2.4.5 PDLLA粘均分子量的测定

2.5 PDLLA的力学性能测试

2.5.1材料

2.5.2脆化温度的定性测定

2.5.3拉伸强度和压缩强度测试

2.6结果与讨论

2.6.1丙交酯的纯化与含量

2.6.2 DL-丙交酯纯度PDLLA分子量的影响

2.6.3反应条件的选择

2.6.4反应时间和温度对PDLLA粘均分子量的影响

2.6.5引发剂用量对PDLLA粘均分子量的影响

2.7超高分子量PDLLA的力学性能研究

2.7.1脆性温度的定性检测

2.7.2拉伸性能和压缩性能测试

2.8本章小结

3马来酸酐改性PDLLA的合成与表征

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1马来酸酐改性PDLLA(MPLA)的制备

3.2.2 MPLA的结构表征

3.2.3 MPLA中马来酸酐含量的测定

3.2.4 MPLA的DSC测试

3.3结果与讨论

3.3.1马来酸酐改性PDLLA(MPLA)的制备

3.3.2 MPLA的红外吸收光谱分析

3.3.3 MPLA的核磁共振分析

3.3.4 MPLA中马来酸酐的含量

3.3.5 MPLA热性能分析

3.4本章小结

4二胺改性聚乳酸(DMPLA)的合成与表征

4.1前言

4.2制备原理

4.3材料与方法

4.3.1二胺改性聚乳酸的制备

4.3.2二胺改性聚乳酸的定性鉴定

4.3.3二胺改性聚乳酸中二胺引入量的定量测定

4.3.4二胺改性聚乳酸的结构表征

4.3.5二胺改性聚乳酸的DSC测试

4.4结果与讨论

4.4.1二胺改性聚乳酸(DMPLA)的定性定量测定结果

4.4.2 DMPLA的红外吸收光谱分析

4.4.3 DMPLA的核磁共振分析

4.4.4 DMPLA的热性能分析

4.5本章小结

5胶原改性聚乳酸(CPLA)的合成与表征

5.1前言

5.2原理

5.3 CPLA的合成

5.3.1材料与试剂

5.3.2实验仪器与设备

5.3.3溶剂的筛选

5.3.4制备与提纯

5.4 CPLA的荧光标记与测定

5.4.1荧光标记原理

5.4.2荧光素

5.4.3 Marsshall氏法荧光标记方法

5.4.4本研究中的荧光标记方法

5.5结果与讨论

5.5.1溶剂的筛选

5.5.2 CPLA的制备与纯化

5.5.3 CPLA的荧光标记与检测

5.6本章小结

6改性聚乳酸的亲疏水性研究

6.1前言

6.2实验部分

6.2.1实验材料与试剂

6.2.2静态水接触角的测定

6.2.3吸水率的测定

6.3结果与讨论

6.4本章小结

7聚乳酸与改性聚乳酸的体外降解性研究

7.1前言

7.2生物降解实验模型的设计

7.3实验部分

7.3.1材料与试剂

7.3.2降解实验步骤

7.4结果与讨论

7.4.1降解过程中的pH值变化

7.4.2分子量(特性粘度)随降解时间的变化

7.4.3失重率随时间的变化

7.5本章小结

8聚乳酸及改性聚乳酸对成骨细胞的相容性初步研究

8.1前言

8.2实验部分

8.2.1材料与设备

8.2.2细胞培养

8.2.3细胞形态学观察

8.2.4细胞增殖检测

8.3结果与讨论

8.3.1细胞形态学观察

8.3.2细胞增殖

8.4本章小结

9结论与后续工作的建议

9.1结论

9.2后续工作的建议

文献综述：聚乳酸及改性聚乳酸的研究现状

致谢

参考文献

附录1 本文中的缩略词

附录2 作者在攻读博士学位期间发表的论文目录

附录3 作者在攻读博士学位期间申请的专利

附录4 作者在攻读博士学位期间参加的科研项目