中药提取物中毒蕈胆碱M1受体激动剂的高通量筛选

摘要

阿尔茨海默病是发病率很高的一种老年性疾病，其特征是胆碱能系统的功能性损伤和脑内淀粉斑的形成，造成的记忆衰退和智力下降。毒蕈胆碱M1受体和阿尔茨海默病有着密切的联系，其激活能有效的改善胆碱能系统活性和抑制脑内淀粉斑的形成，是治疗和减缓该病的有效途径。目前，用于治疗该病的M1受体激动剂选择性不高，给病人造成许多副作用，影响治疗。因此，筛选新型的M1受体的选择性激动剂，开发出治疗阿尔茨海默病的新药，是目前新药开发的一个研究重点。 传统的动物筛选模式劳动强度大，效率低。随着分子生物学、分子药理学、自动化技术、检测技术的进步与结合，高通量药物筛选(Highthroughputscreening，HTS)技术利用分子或细胞水平的药靶进行微量筛选，极大的提高了药物筛选的效率和准确性，是新药筛选的一个有效手段。本文应用重组基因技术，建立了一个适用于高通量药物筛选的M1受体激动剂的筛选模型，并利用该模型对400种中药水提物进行了小规模筛选，寻找M1受体激动剂。 本文所建立的筛选模型将M1受体与报告基因相偶联，即将M1受体基因和报告基因共同转染到HEK293细胞株中，建立一个稳定表达的M1受体细胞株，用以筛选M1受体激动剂。当化合物与膜表面的M1受体结合后，激活M1受体对应的信号级联反应，改变胞内第二信使的表达水平，响应元件响应该变化，促进报告基因的表达，通过检测在细胞溶质中报告基因的量，间接评估化合物的生物活性。 应用该筛选模型，对400种中药水提物进行了小规模筛选，发现了3种对M1受体有生物活性的中药，并对其中一种进行了成分分离，寻找对M1受体有激动剂作用的活性成分，取得了满意的效果。 本课题所建立的筛选模型能够有效的用于M1受体激动剂的高通量筛选和中药活性成分的分离、鉴定，是药物筛选的有效手段。

目录

文摘

英文文摘

1绪论

1.1高通量药物筛选

1.1.1药物筛选模型

1.1.2高通量的样品库

1.1.3自动化工作站

1.1.4高效率的数据处理系统

1.2 G蛋白偶联受体是高通量筛选的重要药靶

1.3 G蛋白偶联受体高通量筛选

1.3.1基于结合分析的检测方法

1.3.2基于第二信使的检测方法

1.3.3基于功能反应的报告基因检测

1.3.4筛选方法的比较

2毒蕈胆碱M1受体

2.1毒蕈胆碱M样受体家族

2.1.1 M受体的四个亚型

2.1.2 M1受体信号通路

2.1.3 M1受体激动剂

2.2 M1受体、阿尔茨海默(AD)病与中药

3毒蕈胆碱M1受体激动剂高通量筛选模型的建立

3.1筛选模型设计

3.1.1基本原理

3.1.2响应元件及启动子的选择

3.1.3报告基因的选择

3.2毒草碱M1受体激动剂高通量筛选模型-M1细胞株的建立

3.2.1材料

3.2.2 M1受体质粒(M1/pcDNA3.1(+))构建

3.2.3报告基因质粒(3×CRE/3×MRE/SRE-LUC/pGL3)

3.2.4 M1稳定细胞株的建立

3.2.5阴性细胞株的建立

4筛选条件的优化及筛选模型的评估

4.1筛选条件优化

4.1.1 96孔板的细胞接种数目

4.1.2荧光素酶的表达时间

4.1.3 Bright-G1o试剂用量

4.2筛选模型的评估

4.2.1 Z'因子分析

4.2.2 Well-to-W色ll波动性检测

4.2.3 Plate-to-Plate波动性检测

4.3 M1细胞株内源性干扰检测

5中药提取库

5.1中药的选择

5.2中药提取

5.2.1仪器装置

5.2.2提取流程

6 M1受体激动剂的筛选

6.1 M1细胞株的中药提取物的筛选

6.2阴性细胞株的中药提取物的筛选

7中药活性成分的分离

7.1实验材料及仪器

7.2实验方法

7.3讨论

8总结及展望

致谢

参考文献

附录 在攻读硕士学位期间发表的学术论文