D1样受体激动剂和klotho启动子激活剂的药物筛选

摘要

本课题的主要研究内容及结果如下:(1)开发了一个报告基因系统,将6个CRE响应元件与一个人工合成的TATATA盒相连,控制报告基因(萤火虫荧光素酶,Luciferase)的表达,能敏感地响应细胞中cAMP水平的变化,这种报告基因系统(6CRE/TA/Luci)适合于Gs和Gi偶联受体的药物筛选.(2)将这样的报告基因系统6CRE/TA/Luci与D1样受体共同转入CHO细胞,建成稳定的细胞株(D5/CRE/TA/Luci/CHO和D1/CRE/TA/Luci/CHO).(3)克隆D5的同时,还克隆到了D5家族的一个新成员(D5B),D5B有98％与D5同源,95％与D5的假基因同源,它介于D5与D5的假基因之间,在与D5不同的地方,则与D5的假基因相同,与D5假基因不同的地方则与D5相同,编码的蛋白比D5多一个氨基酸.D5B属于Gs偶联受体,与D5的不同主要在COOH端,对多巴胺的亲和性比D5大一倍.(4)将klotho基因的启动子与一个报告基因(萤火虫荧光素酶,Luciferase)相连,转入HEK293细胞,建立了稳定的细胞株,这种细胞用终浓度0.006％的H<,2>O<,2>处理,建成了衰老模型,在这种细胞中,klotho启动子受到抑制,萤火虫荧光素酶的活性较低.(5)SBG530是一种草本植物的提取物,对klotho启动子有调控作用,笔者采用生物活性导向分离技术,对SBG530进行了活性物质的分离.总之,我们采用报告基因技术,建立了可行的高通量筛选模型,有效地筛选到了D1样受体的激动剂和klotho启动子激活.涉及的两个药靶都是与衰老相关疾病有关.开发了一个报告基因系统;克隆到一个D5受体家族的一个新成员(D5B),并初步研究了其功能;对能激活klotho启动子的天然提取物SBG530进行了生物活性导向分离.

目录

文摘

英文文摘

英文缩略表

1绪论

1.1高通量筛选是药物发现早期阶段的最好工具之一

1.1.1高通量筛选四要素

1.1.2高通量筛选策略

1.2高通量筛选基本方法简介

1.2.1荧光微体积数字图象测定技术(Fluorometric Microvolume Assay Technology,FMAT)

1.2.2荧光偏振(fLUORESCENCE Polarization,FP)

1.2.3竞争性ELISA测定(competitive ELISA)

1.2.4闪烁邻近测定法(Scintillation proximity assay,SPA)

1.2.5共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)

1.2.6均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF)

1.2.7载黑色素细胞测定法(melanophores assay)

1.2.8报告基因测定法

1.2.9钙离子测定法

1.2.10基于核磁共振(NMR)技术的筛选方法

1.2.11多道毛细管电泳

1.2.12大小排除色谱法

1.2.13过滤板法(filter plate)

1.2.14生物传感器(Biosensor)

1.2.15基于MS的高通量筛选方法

1.3高通量药物筛选的药靶

1.4 G-蛋白偶联受体的高通量药物筛选

1.4.1 G蛋白偶联受体概述

1.4.2 G蛋白偶联受体的药物筛选方法

1.4.3测定方法的选择及发展前景

1.5本文的研究内容

2 D1样受体及其激动剂筛选的意义、原理和技术路线

2.1 D1样受体分布、结构与功能

2.1.1分布

2.1.2结构

2.1.3功能与药理学

2.2筛选D1样受体激动剂的重要意义

2.2.1 D1样激动剂与Parkinson病的治疗

2.2.2 D1激动剂与记忆的改善

2.2.3 D1激动剂与药物成瘾的治疗

2.3 D1样受体激动剂筛选的原理和技术路线

3报告基因系统

3.1 G-蛋白偶联受体的高通量筛选报告基因方法概述

3.1.1报告基因系统的组成

3.1.2报告基因系统的工作原理

3.2报告基因的构建

3.2.1材料

3.2.2方法

3.2.3结果

3.3报告基因系统的功能

3.3.1材料和方法

3.3.2结果

3.4 讨论

4 D1样受体激动剂的筛选

4.1 D1样受体的克隆

4.1.1 D1受体的克隆

4.1.2 D5受体的克隆

4.2D1激动剂药物筛选细胞模型的建立

4.2.1筛选细胞株的建立

4.2.2细胞模型的评估

4.2.3讨论

4.3筛选条件的优化

4.3.1细胞数目对筛选的影响

4.3.2细胞与药物共孵时间对筛选的影响

4.3.3 DMSO浓度对筛选的影响

4.3.4萤火虫荧光素酶底物的浓度对测试结果的影响

4.4 D1激动剂筛选方法的评估

4.4.1评估的原理和方法

4.4.2系统的稳定性评估

4.4.3筛选系统的Z’因子分析

4.4.4讨论

4.5 D1激动剂的筛选和活性物质的确认

4.5.1筛选的实施

4.5.2活性候选物的确认

4.5.3排除假阳性

4.5.4进一步确证

4.6讨论

5 D5受体的多态性，D5B和它的功能

5.1 D5受体的多态性

5.1.1 D5的多态性

5.1.2 D5的假基因

5.2 D5B的序列分析

5.2.1 BLAST分析

5.2.2 D5B、D5和D5一个假基因D5ψ的序列对比

5.2.3 D5B与D1-like受体的比较及功能分析

5.3 D5B的功能

5.3.1报告基因方法评估D5B的功能

5.3.2 cAMP测定

5.4讨论

6 klotho基因及其启动激活剂筛选的意义、原理和技术路线

6.1 klotho基因及其功能

6.1.1 klotho基因与衰老相关疾病

6.1.2 klotho基因及其编码的蛋白

6.1.3 klotho小鼠衰老表型可能的分子机机制

6.2体内调节klotho表达的重要意义

6.2.1Klotho蛋白的功能

6.2.2人的klotho基因与衰老相关的疾病

6.3 klotho启动子激活剂筛选的原理和技术路线

7 klotho启动子激活剂的筛选

7.1 k1otho启动子的克隆

7.1.1 klotho启动子的扫描分析

7.1.2 klotho启动子的克隆

7.2筛选模型的建立

7.2.1建立稳定的细胞株

7.2.2建立衰老细胞模型

7.2.3讨论

7.3筛选条件的优化和筛选方法的评估

7.3.1细胞与药物和H2O2共孵时间对筛选的影响

7.3.2细胞数目和DMSO对筛选的影响

7.3.3筛选系统的评估

7.4 klotho启动子激活剂的筛选和活性物质的确认

7.4.1筛选的实施

7.4.2激活剂的活性表征

7.5讨论

8天然化合物的提取和活性物质的生物活性导向分离

8.1天然物提取和天然物库

8.1.1中药材的选择

8.1.2中药的提取和提取物库的建设

8.1.3讨论

8.2 klotho启动子激活剂的生物活性导向分离

8.2.1药物活性的检测

8.2.2 SBG530中活性成份的导向分离

8.2.3 讨论

9结论

致谢

参考文献

附图与附录

附录I：博士学习期间发表的论文

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