应力刺激对铁皮石斛药用成分含量的影响及其特异基因的初步研究

摘要

环境因子对植物生长的影响是植物生理学和生物物理学中的一个热点。但在环境对植物代谢的影响以及植物是如何感受应力信号的，应力信号又是如何诱导植物基因表达调控代谢等方面的研究极其有限。铁皮石斛是名贵中药材，资源稀少，具有滋阴清热、生津益胃、止咳润肺之功效；其主要成分多糖和总生物碱可提高机体免疫力、延缓衰老。有研究表明，随环境变化兼性景天酸代谢(CAM)植物铁皮石斛的光合碳多谢类型会发生根本性的变化，影响其多糖等成分的含量。 该文以声波刺激为应力加载方式，铁皮石斛的组培苗为材料，从铁皮石斛代谢产物和基因表达水平上分析应力刺激对植物代谢的影响，初步探索应力刺激与植物代谢的关系，以期在理论上深入了解应力对植物代谢的影响，在应用上为植物优良品种的培育及品种改良寻求一种新的方法。 该论文的研究工作和结论如下： (1)研究了声波刺激对铁皮石斛代谢产物含量的影响，结果表明当声波频率为1000Hz、强度为100dB时对铁皮石斛组培苗的多糖合成有明显的促进作用，刺激组多糖含量要明显高于对照组；而对总生物碱的含量影响却不大。 (2)研究了声波对光合速率、呼吸速率的影响。结果表明声波刺激对铁皮石斛正常的光合速率有显著影响、而对呼吸速率功能的影响甚微。提示声波刺激可能诱导铁皮石斛光合碳代谢在CAM方式和卡尔文代谢(C3)方式间转变，提高二氧化碳(CO2)的吸收和利用率，从而增加多糖的含量。 (3)研究了声波刺激下铁皮石斛特异性基因的表达。结果表明处理组的总RNA得率要明显高于对照组的总RNA得率，检测到特异性基因表达条带。用提取的刺激组和对照组总RNA为模板，运用mRNA逆转录差异显示技术(DDRT-PCR)筛选受声波诱导的差异表达基因片段，并对在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离到差异片段进行重扩增，在琼脂糖凝胶上显示的结果表明：SA5、SA8、SG3、SC3、CC7均清晰地显示出基因表达条带，为进一步确定是否为真正受声波诱导而表达的条带，对其进行了Northern杂交。结果有SA5、SG3和CC7与声波处理组总RNA杂交后在胶片上清晰显影，为阳性条带，分子量依次约为370bp、410bp和500bp左右，其中CC7是受到声波处理后而抑制性表达。而SA8对照组和刺激组都有显影，SC3则不显影，说明SA8、SC3为假阳性，提示声波刺激可能会通过基因调控方式影响铁皮石斛的代谢。

目录

文摘

英文文摘

1绪论

1.1引言

1.2铁皮石斛资源概况

1.3铁皮石斛药用成分的分离及其药理药效研究

1.3.1铁皮石斛的化学成分

1.3.2铁皮石斛的药理药效

1.4影响石斛代谢的因素

1.4.1植物生长调节剂对石斛药用化学成分含量的影响

1.4.2环境因子对铁皮石斛药用化学成分含量的影响

1.5应力刺激对植物代谢的影响

1.5.1物理刺激对植物代谢的影响

1.5.2环境因素对植物代谢的影响

1.6应力刺激下植物的特异基因表达及其代谢的基因调控

1.6.1应力刺激下植物基因表达

1.6.2植物代谢的基因调控

1.7本文的主要工作

1.7.1应力加载的模式

1.7.2应力刺激对铁皮石斛代谢的影响

1.7.3应力刺激下铁皮石斛特异表达基因的筛选

1.8本文的研究目的及意义

1.9课题的研究思路与构想

1.10课题的创新之处

2实验材料的培养及声波加载实验模型的建立

2.1引言

2.2实验材料的培养

2.2.1取材

2.2.2培养基的配制

2.2.3铁皮石斛原球茎的培养

2.2.4铁皮石斛幼苗的培养

2.3加载方式的选择

2.3.1实验加载装置

2.3.2实验材料处理

3声波刺激对铁皮石斛药用成分含量的影响

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2仪器与试剂

3.2.3多糖的提取精制

3.2.4铁皮石斛多糖的提取和含量测定

3.2.5铁皮石斛总生物碱的提取和含量测定

3.2.6光合速率的测定

3.2.7呼吸速率的测定

3.3结果

3.3.1声波刺激对铁皮石斛多糖含量的影响

3.3.2声波刺激对铁皮石斛总生物碱含量的影响

3.3.3声波对铁皮石斛苗光合速率和呼吸速率的影响

3.4讨论

3.4.1测定方法考察

3.4.2声波刺激对铁皮石斛多糖代谢的影响

4铁皮石斛总RNA提取和分析

4.1引言

4.2实验材料和方法

4.2.1总RNA的提取流程

4.2.2总RNA的提取流程

4.3总RNA质量和完整性测定

4.3.1分光光度法测定RNA质量和纯度

4.3.2 RNA完整性鉴定

4.4实验结果

4.4.1声波刺激组和对照组铁皮石斛总RNA质量

4.4.2声波刺激组和对照组铁皮石斛总RNA纯度

4.4.3声波刺激组和对照组铁皮石斛总RNA完整性

4.5讨论

4.5.1富含多糖物质中总RNA的提取

4.5.2声波刺激对铁皮石斛中总RNA含量的影响

5声波刺激下铁皮石斛的差异基因表达

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1材料

5.2.2引物

5.2.3反转录RNA

5.2.4 PCR扩增

5.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳

5.2.6银染

5.2.7差异条带的回收

5.2.8差异条带的重扩增

5.2.9重扩增产物的电泳

5.2.10重扩增产物的回收和纯化

5.2.11 Northern Blot杂交

5.3结果与分析

5.3.1差异基因的凝胶筛选结果

5.3.2回收差异条带及重扩增

5.3.3 Northern Blot杂交

5.4讨论

5.4.1声波应力与铁皮石斛特异表达基因

5.4.2 Northern Blot杂交中值得注意的问题

6应力-代谢关系模型的初步建立及其探讨

6.1引言

6.2应力-代谢关系模型的初步建立

6.3应力-代谢关系的初步探讨

6.3.1应力刺激的物理学效应对代谢的影响

6.3.2应力刺激的生物学效应对代谢的影响

6.3.3声波的生物学效应对植物代谢的影响

7结论

7.1全文的主要结论

7.1.1声波刺激对铁皮石斛代谢的影响

7.1.2声波刺激下铁皮石斛代谢调控基因的表达

7.2后续工作建议

致 谢

参考文献

附录1作者在攻读硕士学位期间发表的论文

附录2作者在攻读硕士学位期间参加科研项目

附录3英汉对照表

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