肝癌细胞在不同受体趋化剂中的趋化行为及其与整合素和细胞骨架的关系

摘要

趋化最初是单细胞生物某些细胞最基本最原始的运动形式，像变形虫，溶组织阿米巴等靠体表任何部位形成的临时性的细胞质突起（伪足）作为运动器而运动。很多资料认为：伪足的形成是由于骨架再组装驱动，特别是肌动蛋白微丝骨架的重组。伪足作为一个突出的小泡出现在显微镜下，有时沿着下层基质变的扁平（像扁平足），有时更圆或离开表面（像头足）。从荧光显微镜或电子显微镜发现：这个区域总是包含有密集的F-actin微丝网络和少量的微管。尽管actin微丝在伪足形成时所起的作用或多或少的已被接受，人们对于产生推力的机理仍旧有不同的意见。涉及到推力的模型从肌动蛋白在膜上直接起作用，到肌浆球蛋白的收缩，或可利用的凝胶渗透压驱使F-actin微丝网络凝胶化等等均被提出来说明伪足的扩展。 本文应用生物力学、细胞生物学、光镜和电镜技术以肝实质癌细胞（hepatocellular carcinoma cells，HCC）为研究对象，用不同受体的趋化剂作用于肝癌细胞SMMC-7721株，通过微吸管吸吮技术和Boyden小室来研究其趋化特性，观察肝癌细胞在趋化剂IV型胶原、层粘连蛋白、组织胺作用下对细胞伪足相互作用的影响。本研究方法具有直观、精细，易定量的特点；深入研究癌细胞趋化行为和分子机制，进而防治侵袭和转移，具有现实意义。 本课题的主要研究内容及结果如下： （1）用单微吸管法研究肝癌细胞在IV型胶原（type IV collagen，Col IV）、层粘连蛋白（laminin，LN）、组织胺（Histamine）趋化作用下伪足生长的动态过程，同时考察了肝癌细胞伪足的形成分别对趋化液中ColIV、LN和组织胺浓度的依赖性。随着ColIV趋化剂浓度的增加（100 μg/ml~400 μg/ml），HCC细胞的伪足长度增加；当ColIV浓度≥400 μg/ml时，细胞伪足的长度基本不变。随着LN趋化剂浓度的增加（50 μg/ml~200 μg/ml），HCC细胞的伪足长度增加；当LN浓度≥200 μg/ml 时，细胞伪足的长度基本不变。而组织胺（0.05 ng/ml~500 ng/ml）对肝癌细胞无趋化特性。 （2）应用双微吸管法研究浓度不对称趋化实验中双侧伪足形成的相互影响和趋化剂种类不同时趋化性伪足形成的强度。结果表明：一侧ColIV浓度固定，另一侧随着组织胺浓度升高，细胞伪足长度逐渐降低；双侧伪足一侧因组织胺趋化浓度升高而伪足生成减弱并未使另一侧伪足生成增强。随着组织胺浓度增加（0.5 ng/ml~50 ng/ml）组织胺浓度为0.5 ng/ml，5 ng/ml和50 ng/ml时，伪足的峰值长度分别为3.03±0.54 μm，0.94±0.52 μm，2.07±0.55 μm。，伪足的峰值在5 ng/ml时降到最低。另侧在ColIV浓度为200 μg/ml趋化下伪足的长度跟单微吸管同样浓度趋化作用下伪足长度无明显差别 。 （3）用单微吸管法研究用细胞松弛素D（cytochalasin D，CD）及钙离子（Ca2+）作用于细胞后，IV型胶原趋化作用下伪足形成的趋化过程。随着CD浓度的增加（0.5 μg/ml~2.0 μg/ml），HCC伪足长度减小，当CD浓度为2.0 μg/ml时，细胞伪足的长度最短；随着Ca2+浓度的增加（1 μmol/l~3.0 μmol/l），HCC伪足长度减小，当Ca2+浓度为3.0 μmol/l时，细胞伪足不再形成。光镜和电镜技术显示了细胞骨架的变化。加入2.0 μg/ml 浓度的CD和3.0 μmol/l Ca2+化后，细胞骨架的分配与未加入干扰剂的对照组相比，骨架大部分发生紊乱，小部分开始溶解甚至消失。 （4）采用单微吸管研究整合素单克隆抗体Anti-CD49a~Anti-CD49d阻断后，IV型胶原趋化作用下伪足形成的趋化过程，以证实付遍红的结果。随着微吸管内Anti-CD49a和Anti-CD49d混合物浓度的增加（5 μg/ml，10 μg/ml ，20 μg/ml），HCC仍有明显伪足形成同时与肝癌细胞未阻断时的伪足长度相比，伪足的变化不明显（P>0.05）。而随着Anti-CD49b和Anti-CD49c浓度的增加（0.5 μg/ml~2.0 μg/ml），在抗体浓度较低（5 μg/ml）时，仍可见有伪足形成；当抗体浓度较高时(≥10 μg/ml)，此时与肝癌细胞经Anti-CD49b或Anti-CD49c阻断时伪足长度相比，伪足受到明显的抑制（P<0.01）。 （5）采用Boyden小室来研究在Boyden小室中伪足在不同浓度的ColIV和组织胺趋化液作用下伪足的趋化迁移性。在ColIV浓度为200 μg/ml时，细胞移动数目为541.06±40，ColIV浓度为400 μg/ml，600 μg/ml时，细胞移动数目分别为720.36±60，924.21±71。当ColIV浓度≥600 μg/ml，细胞移动数目基本不变；而组织胺几乎无趋化性。然后研究细胞松弛素D和组织胺对群体细胞在ColIV趋化下的迁移运动的影响。用细胞松弛素D作用于HCC后，随着浓度的增大（0.5 μg/ml~2.0 μg/ml），细胞移动的数目逐渐减少，对其的迁移运动的抑制较控制组显著（p<0.01）。而组织胺作用于细胞后，细胞移动数目减少，当组织胺浓度为10-10,10-9 ,10-8,10-7 mol/L时，细胞移动数目分别是939.2±41，831.1±52，521.2±89，648.9±75，细胞迁移性降低，在组织胺浓度为10-8 mol/L时细胞移动数目最低，与控制组相比，差异显著（p<0.01）。 从实验的结果可以得到以下几个结论： （1）当单微吸管内加入不同浓度的Col IV和LN趋化剂，HCC细胞向趋化液中的伪足生长呈现明显的浓度依赖性，和一定的浓度饱和性。当细胞在400 μg/ml Col IV和200 μg/ml LN趋化作用下，其伪足形成达到饱和状态，说明趋化液配体与细胞膜上受体结合分子数达到饱和；而组织胺0.05 ng/ml~500 ng/ml对肝癌细胞无趋化性。当微吸管两侧对于不同浓度的趋化剂，HCC细胞向ColIV和组织胺中伪足的长度随着组织胺浓度的升高而缩短，在组织胺浓度为5.0 ng/ml，伪足长度最小，抑制显著，而组织胺侧伪足的缩短并未对另侧细胞伪足的形成造成明显的影响。 （2） 当细胞骨架干扰剂细胞松弛素D和钙离子于ColIV趋化剂作用下，细胞松弛素D的浓度为0.5 μg/ml~2 μg/ml时，Ca2+浓度为1μmol/l~3.0μmol/l时，细胞伪足的生长与控制组相比抑制显著（P<0.01），并具有浓度依赖性。及光镜和电镜下骨架的紊乱无序及溶解，说明细胞骨架干扰剂通过引起胞内微丝骨架的解聚而抑制伪足的形成，即细胞骨架是形成伪足的原动力。 （3） 整合素单抗Anti-CD49a~Anti-CD49d处理细胞后，Anti- CD49b、Anti- CD49c(10 μg/ml ，20 μg/ml)对肝癌细胞在IV型胶原趋化运动时伪足的生长与单个单抗作用相比有较强的抑制作用（P<0.01），表明α2 、α3是IV型胶原的效应受体。 （4） 在Boyden小室中伪足在不同浓度的ColIV趋化液作用下呈现明显的趋化迁移性；细胞松弛素D则主要通过破坏微丝骨架，抑制细胞迁移；组织胺抑制细胞的迁移，也许通过改变受体的活性，或钙离子的流量，从而引起细胞骨架的解聚所致。证实了前面第二、三章内容所示的结论。