拉伸加载装置的研制及拉伸对骨髓间充质干细胞增殖的调节作用

摘要

骨髓间充质干细胞（MSCs）是中胚层来源的具有多向分化潜能的干细胞，存在于不同种属的动物体内（如鸡、鼠、兔、犬、人），主要分布在全身的结缔组织及组织器官中，以骨髓组织中的含量最为丰富。在不同的诱导条件下，MSCs具有向成骨细胞、成肌细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和基质细胞等中胚层细胞分化的能力，同时还可分化为外胚层的神经细胞和内胚层的肝细胞。随着组织细胞工程学和基因工程学的发展，利用MSCs的多向分化的潜能，将其运用于组织工程、细胞因子替代治疗、基因治疗、细胞移植及器官移植等方面的研究已成为热点。 然而，MSCs在体内含量很少，骨髓中每10万单核细胞中大约有1个MSCs，且随着年龄的增长，MSCs数量逐渐减少。显然，如此微量的MSCs根本难以满足细胞工程的需要。因此，如何摸索一个适宜的体外纯化、扩增的培养条件，对于进一步研究MSCs的生物学特性、诱导分化和细胞移植就显得尤为重要。 体外调节MSCs增殖的方法有很多种，其中力学刺激是一种重要的途径。近年来，力学因素对细胞和组织生长发育的调节一直是生物力学十分重视的研究领域，国内外学者已经在这一领域作了大量的研究工作，积累了丰富的研究经验。拉伸是力学刺激中的一种有效方法，文献显示：最佳刺激条件的拉伸能促进细胞增殖。但目前利用力学拉伸加载作用调节MSCs增殖的研究尚未见详细文献报道，其机理更不清楚。本实验拟研制拉伸加载装置，选取大鼠作为实验材料，进行MSCs的原代分离、培养、鉴定。然后在一定条件下对MSCs的进行拉伸刺激，研究分析拉伸刺激后MSCs的增殖情况，从中找到在设定范围内，该拉伸装置刺激MSCs增殖的最佳条件，并为以后MSCs在力学拉伸刺激下的定向分化及进一步研究打下良好基础。 本实验的研究方法和主要研究内容包括：首先，研制一套符合实验要求的拉伸加载装置，初步设定拉伸参数，进行相关预实验检测；同时，选取成年大鼠作为实验动物，采用Percoll梯度离心法结合贴壁筛选法分离提取MSCs，培养传代，进行相关鉴定；然后使用拉伸加载装置，在一定的条件下，对MSCs进行拉伸刺激，采用MTT法分析增殖影响，分子生物学相关技术分析与增殖相关的c-fos基因的表达变化，从中研究不同的拉伸刺激条件对MSCs增殖的相应影响，并总结出在设定的参数范围内，本实验研制的拉伸加载装置刺激MSCs增殖的最佳拉伸条件。 本实验的研究结果如下： 一、拉伸加载实验装置的研制： 根据圆形基底膜形变拉伸原理，研制了弹性膜周期加载装置，运用数字电路进行控制，LED显示，参数易于控制，线性可调。刺激频率范围0.1-1Hz，刺激大小范围2％-15％，刺激时间人工调节，能满足实验要求。 二、MSCs的原代分离和培养 通过Percoll离心法（Percoll密度为1.073g/mL）得到的单核细胞24小时后贴壁，细胞呈圆形，72小时后呈纺锤形、梭形、多角形，增殖迅速，原代培养约14-20天左右可达到80-90％融合。传代细胞24小时内完全贴壁，5-7天内达到80-90％融合。传代至6-8代。运用免疫组化方法检测了大鼠MSCs的4种表面抗原的表达情况。结果显示：CD34（造血干细胞标记物）阴性；CD44阳性；CollagenⅠ阴性；Fibronectin阳性。细胞周期分析：G0/G1细胞占93.7％，说明大部分细胞处于非增殖状态。成骨细胞诱导液诱导后，细胞表达成骨细胞的标志AKP，出现钙化点，并随着时间的延长而加深。证明所培养的细胞为大鼠MSCs。 三、拉伸对MSCs的增殖影响 在1Hz刺激频率下，通过三种刺激时间（15分钟、30分钟、60分钟），三种刺激大小（2％、4％、8％）的拉伸，MTT结果显示：在拉伸刺激下，MSCs有不同程度增殖；方差分析显示刺激时间对MSCs的增殖影响大于刺激大小的影响；在设定范围内，最佳刺激条件是刺激大小为8％，刺激时间为60分钟；分子生物学技术分析结果显示c-fos基因表达增强。 通过分析，可以认为本实验研制的拉伸加载装置能初步满足研究需要。而采用Percoll梯度离心法结合贴壁筛选法可以比较简单有效地获得MSCs，通过免疫组化方法检测表面抗原及碱性磷酸酶活性的检测，可以证实培养的细胞是处于未分化状态的MSCs。拉伸刺激实验结果显示：在不同拉伸刺激下，MSCs均有不同程度增殖。整个实验实现了预期目的，为MSCs在拉伸刺激下的定向分化和进一步实验奠定了基础。