应用基因芯片筛选植物激活蛋白处理水稻相关差异基因及其验证

摘要

植物激活蛋白是从交链孢真菌（Alternaria.spp）中提取分离的一种新型多功能蛋白，该蛋白本身无毒，能提高植物的过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和脯氨酸的含量，通过激活植物体内分子免疫系统，提高植物自身免疫力，促进植物根茎叶生长，从而达到提高作物产量的目的，其潜在的基因水平的机制尚不清楚。 基因芯片(Gene chip)又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray), 其中基因表达谱芯片(Gene expression profiling)是目前应用最为广泛的基因芯片。表达谱芯片可以分析不同来源的mRNA转录杂交的差异，通过分析表达谱基因芯片，可从整体水平研究代谢机制，认识基因相互之间的网络关系，发现重要基因。传统的RNA方法学，如Northern杂交分析，一次只能研究一种基因，成本高，效率低；而新兴的基因芯片技术，提供了一种基因差异表达的高通量研究工具。 本实验研究目的是用2 mg /ml植物激活蛋白处理水稻幼苗，应用基因表达谱检测相关差异基因的表达，建立植物激活蛋白诱导水稻相关基因表达谱，为深入揭示该激活蛋白的作用机制研究提供依据。研究方法：提取处理组和对照组的RNA，纯化，逆转录，用Cy5和Cy3分别标记cDNA，将两种荧光探针混合，与载有10 368位点的水稻表达谱cDNA基因芯片进行杂交并用芯片扫描系统进行扫描，通过Cy5与Cy3信号强度比值的计算得到差异表达基因，对差异表达基因进行生物信息学分析，采用RT-PCR技术对10个差异表达基因进行验证，并对10个差异表达基因的时序变化情况进行初步研究。研究结果：实验设计两次重复，其中芯片1得到差异表达基因256条，其中表达上调的50条；芯片2得到差异表达基因499条，其中表达上调的有98条，在两张芯片中都差异表达基因97条，其中上调基因4条，下调基因93条。RT-PCR验证结果显示：在两张芯片中都表现为上调的基因为阳性与芯片结果一致；在单张芯片中上调的基因表现为上调与芯片结果不完全一致。结论：1) 本实验成功地将基因芯片技术应用于激活蛋白处理水稻差异表达基因的筛选中，得到两张芯片中共同差异表达的基因97条，其中4条基因呈上调表达，93条基因呈下调表达；2) 通过对筛选出的差异表达基因进行生物信息学分析及归类，这些基因按功能分类可分为参与包括光合作用、信号转导、表达调控、代谢、发育相关、核糖体蛋白、转运类蛋白等几大类别及一些功能未知基因；3) 应用RT-PCR技术对10条差异表达基因进行鉴定，结果显示：在两张芯片中都表现为上调的基因为阳性与芯片结果一致；在单张芯片中上调的基因表现为假阴性；4) 将基因芯片技术引入激活蛋白处理水稻差异表达基因的筛选的研究中是可行的，并且有巨大的应用前景。勿庸置疑，运用基因芯片筛选差异表达基因仍存在假阴性和假阳性等缺点，毕竟芯片的研发才经历了短短的十余年，并且国内在这方面的研发也仅是起步而已。本次研究中，8条在单张芯片中差异表达的上调基因也不完全符合RT-PCR的鉴定结果。基因芯片技术是一个有效的高通量基因表达分析手段，但芯片实验的重复性并不非常理想，需要进行重复以提高结果的可信性。