一种基于MEMS和细胞电场效应的细胞融合方法的研究

摘要

细胞融合是细胞工程最基本的核心技术之一，是细胞工程研究的重要内容。细胞融合技术已逐步从动物细胞的融合扩展到植物细胞、微生物细胞，甚至真菌的融合，导致了细胞工程技术的新突破。尽管细胞融合技术已经取得了长足进展，但仍然存在着诸多问题。针对目前正在使用的细胞融合技术的不足，本论文研究了一种微型化、可视化、集成化程度高、低成本、不会对细胞产生毒害作用、低电压驱动的细胞融合方法，并研究了与之密切相关的电介质电泳效应。这些研究工作对于发展细胞融合的相关理论和技术具有积极的作用，是在国内具有开拓性和创新性的工作。 本论文的主要研究内容如下： (1)本论文应用细胞工程中的细胞融合理论、电介质物理理论、电场对细胞的作用理论，结合MEMS(MicroElectroMechanicalsystems，微机电系统)技术，研究了一种新型的细胞融合方法。设计并制作完成一种基于MEMS技术和细胞电场效应的、可用于细胞融合的新型芯片——细胞电场效应融合芯片(CellinElectrical-fieldFusionMicrochip，CEFM)。在理论分析和实验研究的基础上，并充分参考细胞融合电场诱导法中的相关技术参数，确定了芯片工作的电学条件。设计、制作完成驱动芯片工作的外围电路子系统，驱动细胞电场效应融合芯片正常工作。 (2)根据电介质物理理论和电场理论，在具体研究中特别注意了细胞的电场效应，研究了与CEFM密切相关的细胞电介质电泳效应，构建了细胞在CEFM中的电场效应模型(包括CEFM中悬浮液细胞的电学模型、CEFM中悬浮液细胞的电偶极子模型等)。并在理论分析基础之上，结合细胞电场效应融合芯片的研究进行了相关实验研究。相关工作成果指导了细胞融合芯片及其驱动电路的研制，这部分内容的理论分析与实验研究是CEFM相关研究的第一环节，也是CEFM相关研究中的基础研究环节。 本论文取得了以下主要研究结果： (1)在关于细胞融合芯片中细胞排队方法的研究中，本论文先后研究了基于MEMS的微小室阵列和微电极阵列两种细胞融合芯片的设计思路和方案，并通过实验验证了微电极阵列细胞融合芯片的可行性； (2)根据霍奇金-赫克利斯模型利用类比分析法构建起CEFM中悬浮液细胞的电学模型，从电介质物理Maxwell-Wagner的界面极化理论出发，构建了CEFM中悬浮液细胞的电偶极子模型。并进一步构建了CEFM细胞悬浮液中细胞的介电模型、CEFM内单细胞电介质电泳效应模型和CEFM内多细胞电介质电泳效应模型。并导出了CEFM内细胞电介质电泳力FDEP的理论全表达公式。理论和实验分析结果证明了，应用细胞的电介质电泳效应操控CEFM内细胞进行定向迁移的可行性； (3)在关于细胞电场效应融合芯片的研究中应用类似“尖-平板”状的微电极和交叉梳状电极组结构实现高场强梯度电场。在此微电极结构的设计基础上，先后详细研究了三维微电极阵列和二维微电极阵列两种微电极阵列的方案。最终用二维微电极阵列的设计方案设计加工了芯片； (4)论文定量分析了细胞融合的前两个过程：细胞排对、细胞膜穿孔，在充分参考先验数据，并结合理论模型分析的基础上，推导了有关驱动细胞电场效应融合芯片的电信号的技术参数(输入CEFM电信号的波形、幅值、频率、时长，以及波形序列)。积极研制出驱动CEFM的“细胞电场效应融合仪”，其各项指标基本达到预先的设计要求； (5)构建了基于细胞电场效应融合芯片CEFM的细胞融合实验平台，并在该实验平台上对第一批CEFM芯片进行了有关“细胞电介质电泳的实验研究”和“细胞膜瞬时可逆性电穿孔”实验研究。在实验中观察到细胞在芯片内的微通道内排列成对，且排队作用明显，同时观察对细胞融合现象的发生。所进行的实验研究结果与理论模型相互印证，所得到的结果对发展以MEMS技术为基础的新细胞电融合技术具有积极的理论与实践意义。 上述研究结果的取得，为利用MEMS技术发展新型细胞融合技术提供了积极的理论指导和坚实的实践基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：量纲和单位及专业名词中英（缩写）对照

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1 绪论

1.1 前言

1.2 细胞融合的基本概念及其研究意义

1.2.1 细胞融合的概念

1.2.2 细胞融合研究的意义

1.3 细胞融合电场诱导技术

1.3.1 细胞电融合技术的发展

1.3.2 细胞电融合技术的原理

1.3.3 细胞电融合技术的扩展

1.3.4 细胞电融合技术的应用

1.3.5 细胞电融合技术的优缺点

1.4 其它细胞融合技术

1.4.1 细胞融合生物诱导法

1.4.2 细胞融合化学诱导技术

1.4.3 细胞融合激光诱导法

1.5 对目前细胞融合技术的综合分析及问题的提出

1.6 本论文的研究内容

1.6.1 CEFM的研制及外围电路子系统的设计制作

1.6.2 基于CEFM的细胞电介质电泳效应研究

1.6.3 本论文的研究方案及所遵循的技术路线

1.7 本论文的研究目标

1.8 本文的研究意义

1.8.1 关于细胞电场效应融合芯片（CEFM）的研究意义

2 关于细胞融合芯片中细胞排队方法的研究

2.1 细胞融合过程的分析及问题的提出

2.1.1 细胞相互接触（细胞排对）

2.1.2 细胞膜穿孔

2.1.3 质膜连接

2.1.4 细胞融合芯片中细胞排队问题的提出

2.2 基于MEMS的微小室阵列细胞融合芯片的设计思路和方案

2.2.1 微小室阵列细胞融合芯片的设计

2.2.2 微小室阵列细胞融合方案的微流路和微压力控制子系统的设计

2.2.3 微小室阵列细胞融合芯片的设计方案的综合评价

2.3 基于MEMS的微电极阵列细胞融合芯片的设计思路和方案

2.3.1 微电极阵列是悬浮细胞的电场效应

2.3.2 CEFM微电极阵列拟采用的电场效应

2.4 利用电极（阵列）实现细胞向迁移的验证实验

2.4.1 实验目的

2.4.2 细胞的选取与培养操作

2.4.3 实验材料和仪器

2.4.4 计算

2.4.5 实验方法

2.4.6 实验一（SMMC—7721细胞的定向迁移实验）的结果

2.4.7 实验二（HepG2细胞的定向迁移实验）的结果

2.4.8 实验三（鱼卵细胞的定向迁移实验）的结果与讨论

2.4.9 实验讨论

2.5 本章小结

3 悬浮细胞在微电极中的理论模型与实验研究

3.1 引言

3.2 构建CEFM内悬浮液细胞的电学模型

3.2.1 CEFM内悬浮液细胞的电学基本模型

3.2.2 CEFM内悬浮液细胞的电偶极子模型

3.3 碳纤维微电极小室的电场效应实验

3.3.1 微电极的制作

3.3.2 实验仪器和材料

3.3.3 计算

3.3.4 实验过程

3.4 实验结果及其分析

3.4.1 DC作用下的实验结果及细胞的电泳效应的分析

3.4.2 AC作用下的实验结果及其初步分析

3.4.3 讨论

3.5 CEFM细胞悬浮液中细胞的介电模型

3.5.1 CEFM内复介电系数和复电导率的定义及表达推导

3.5.2 CEFM细胞悬浮液中细胞的介电特性

3.5.3 CEFM细胞县浮液中细胞介电特性的拜(Debye)表示

3.6 CEFM内细胞悬浮液的细胞电介质电泳效应模型

3.6.1 CEFM内单细胞电介质电泳效应模型

3.6.2 CEFM内多细胞电介质电泳效应模型

3.6.3 CEFM内细胞悬浮液的电介质电泳频谱分析

3.7 碳纤维微电极小室实验中AC电场效应的分析

3.7.1 碳纤维微电极小室实验中细胞的介电特性

3.7.2 碳纤维微电极小室实验中细胞的的电介质电泳频谱分析

3.7.3 极化作用系数与细胞县浮液电导率的相关性研究

3.8 基于CEFM的细胞的定向迁移方式的比较与选择

3.9 本章小结

4 关于细胞电场效应融合芯片的研究

4.1 引言

4.2 微电极的设计原理

4.3 三维微电极阵列细胞电场效应融合芯片

4.3.1 三维微电极阵列细胞电场效应融合芯片设计及加工

4.3.2 系统构建

4.3.3 三维微电极阵列细胞电场效应融合芯片的加工难度

4.4 二维微电极阵列细胞电场效应融合芯片

4.4.1 芯片的结构设计概述

4.4.2 芯片结构设计的技术细节

4.4.3 细胞电场效应融合芯片结构设计的具体实施方式

4.4.4 小结

4.5 基于Conventor Ware的细胞电场效应融合芯片设计

4.5.1 细胞电场效应融合芯片的版图设计

4.5.2 CEFM的三维建模及电荷电场仿真

4.6 基于MEMS的细胞电场效应融合芯片的微加工制造

4.6.1 芯片SOI材料选择的分析与制备

4.6.2 基于SOI材料的芯片体策加工

4.6.3 出片

4.6.4 引线及封装

4.7 CEFM中微电极电场强度理论研究

4.8 本章小结

5 关于细胞电场效应融合芯片的电学研究

5.1 引言

5.2 驱动细胞电场效应融合芯片工作的电学信号

5.3 关于驱动CEFM细胞排队信号的研究

5.3.1 细胞排队信号的波形

5.3.2 细胞排队信号的频率

5.3.3 细胞排队信号的幅度

5.3.4 细胞排队信号的持续时间

5.3.5 小结

5.4 关于驱动CEFM细胞穿孔信号的研究

5.4.1 细胞电穿孔信号的波形

5.4.2 CEFM内细胞在电穿孔信号作用下的界面极化

5.4.3 跨膜电位与细胞形状、大小的关系

5.4.4 电导率因子

5.4.5 细胞膜瞬时可逆性电穿孔的临界电压

5.4.6 细胞穿孔信号的波形幅度

5.4.7 细胞穿孔信号的脉冲宽度和持续时间

5.4.8 小结

5.4.9 驱动信号的改进及负载匹配

5.4.10 负载匹配

5.4.11 结论

5.5 CEFM驱动信号的实现方式

5.5.1 利用函数信号发生器产生CEFM的驱动信号

5.5.2 利用虚拟仪器产生CEFM的驱动信号

5.5.3 利用高频函数芯片产生CEFM的驱动信号

5.6 细胞电场效应融合仪的电路设计

5.6.1 控制电路

5.6.2 智能化宽频带函数信号发生芯片电路

5.6.3 D/A转换模块

5.6.4 波形调制电路

5.6.5 放大电路

5.6.6 显示模块

5.6.7 硬件设计中应注意的问题

5.7 细胞电场效应合仪的软件设计

5.7.1 设计规则及总体程序设计

5.7.2 参数设置模块设计

5.7.3 信号调频模块设计

5.7.4 信号调制模块设计

5.7.5 时间调制模块设计

5.7.6 LED显示模块设计

5.8 细胞电场效应融合仪的性能检测

5.8.1 总体样机

5.8.2 细胞电场效应融合仪的整体信号的检测

5.8.3 排队信号的检测

5.8.4 脉冲信号的检测

5.8.5 加负载后的信号的检测

5.8.6 复位后信号的检测

5.8.7 小结

5.9 本章小结

6 基于CEFM的实验研究

6.1 基于CEFM的细胞融合的实验

6.1.1 基于CEFM的细胞融合实验平台的建立

6.1.2 关于细胞融合缓冲液电导率的确定

6.1.3 实验仪器和材料

6.1.4 实验方法

6.2 基于CEFM中SMMC-7721细胞电介质电泳的实验

6.2.1 实验结果

6.2.2 关于SMMC-7721细胞密度的数据分析

6.2.3 细胞的极化作用系数K值的测定

6.2.4 CEFM中SMMC-7721细胞电介质电泳频谱的测定及其分析

6.2.5 实验中出现的问题及解决方法

6.3 基于CEFM中7721细胞膜瞬时可逆性电穿孔的实验研究

6.3.1 实验结果

6.3.2 CEFM内SMMC-7721的跨膜电位

6.3.3 界面极化及膜穿孔的临界电压

6.4 本章小结

7 结语与展望

7.1 本论文取得的进展

7.2 论文的创新之处

7.3 论文研究工作的不足之处

7.4 展望

致 谢

参考文献

附录A：细胞介电质电泳融合芯片的科技查新报告

附发B：作者攻读博士学位期间发表的论文及参加科研情况