一种人端粒酶逆转录酶基因启动子的重组与功能鉴定

摘要

肿瘤细胞的形成与端粒酶活性有着较高的相关性，利用端粒酶为靶点来进行肿瘤基因治疗以及控制干细胞移植过程中的瘤变问题，其关键在于获取一种具有高度转录特异性及转录频率的人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)基因启动子片段。然而天然hTERT启动子在转录活性与特异性方面不够理想，为获取一种在端粒酶表达阳性细胞中具有高特异性和较强转录活性的hTERT基因启动子，我们以天然hTERT基因编码序列启始子ATG上游270bp碱基序列为基本框架结构，进行启动子重组设计，在其下游接入四个E—box(CACGTG)重复序列结构，用化学合成法将该序列进行人工合成并亚克隆入PUC57克隆载体中；构建表达增强型绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescentprotein，eGFP)报告基因的慢病毒载体，并用重组的hTERT基因启动子片段取代慢病毒载体eGFP上游的巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子；将新得到的重组慢病毒载体用脂质体介导法转入端粒酶阳性的人胚肾上皮肿瘤细胞(293FT)、肝癌细胞(HepGⅡ)、胃癌细胞(SGC7901)及端粒酶阴性的人骨肉瘤细胞(U2OS)中进行功能鉴定；为进一步验证重组hTERT基因启动子在正常细胞中的转录活性及特异性，将重组慢病毒载体包装成病毒颗粒后感染原代培养的人成纤维细胞，并用激光共聚焦显微镜检测报告基因的表达。实验结果显示：在293FT、HepGⅡ、SGC7901细胞中均可以观测到肉眼可见的绿色荧光蛋白的表达；在端粒酶阴性的U2OS细胞中没有观测到绿色荧光蛋白的表达；在原代培养的人成纤维细胞中没有观测到绿色荧光蛋白的表达。实验结果表明所重组的hTERT基因启动子在端粒酶表达阳性的细胞中具有较强转录活性及特异性，

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声明

1绪论

1.1研究背景及意义

1.2研究现状

1.2.1hTERT基因、hTERT基因启动子及其应用

1.2.2真核基因启动子的功能鉴定

1.3本文的研究方案及实验流程

2 hTERT基因启动子的重组及慢病毒载体构建

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2实验方法

2.3结果

2.3.1 PCR扩增eGFP基因结果

2.3.2重组质粒pLenti-pCMV-eGFP的鉴定

2.3.3质粒PUC57-phTERT与pLenti-pCMV-eGFP经BamH Ⅰ、Cla Ⅰ双酶切的结果

2.3.4双酶切产物的菌液PCR筛选及提取质粒的PCR鉴定结果

2.3.5三种质粒经BamH Ⅰ、Cla Ⅰ双酶切的结果

2.3.6测序结果

2.4讨论

2.4.1关于hTERT基因启动子序列重组的设计

2.4.2关于实验中所遇问题的解决

3重组hTERT基因启动子的功能鉴定

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果

3.4讨论

3.4.1关于脂质体介导的转染技术

3.4.2转染效率及影响因素

3.4.3关于实验方案及实验结果

4结论、创新性、不足之处及展望

致 谢

参考文献

附 录