趋化因子受体CXCR4表型敲除抑制乳腺癌转移的研究

摘要

本课题首次采取细胞内趋化因子突变体策略，构建含有SDF-1的突变体SDF-1α/54 与内质网定位片段KDEL的嵌合基因的重组真核表达载体和腺病毒表达载体，其表达的细胞内趋化因子突变体SDF-1α/54/KDEL 蛋白可在细胞内与同时与新合成的靶受体CXCR4产生特异性结合，并滞留于内质网形成复合物，随后被泛素蛋白等途径分解。抑制CXCR4在细胞表面的表达，从而阻止了CXCR4/SDF-1与乳腺癌转移有关的通路，研究结果将为探究以CXCR4为靶点的肿瘤基因治疗提供直接的实验依据。 目的： ①采用 RT-PCR 等方法从健康成人骨髓组织中克隆人基质细胞衍生因子(hSDF-1)野生型成熟肽编码序列(SDF-1wt)，定向插入原核克隆表达质粒pET-30a(+)，构建其原核表达系统。以此为基础进行删除C末端结构域的缺失突变，为实施细胞内趋化因子突变体提供物质基础； ②构建人SDF-1α细胞内趋化因子突变体SDF-1α/54/KDEL 的重组真核表达质粒，并考察其对T细胞性白血病细胞株Molt-4细胞表面受体CXCR4表达的影响，及对细胞趋化和生长的影响，为表型敲除肿瘤细胞表面受体 CXCR4 以抑制肿瘤的转移提供初步实验依据； ③构建携带含细胞内趋化因子突变体 SDF-1α/54/KDEL 基因片段的重组腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL,考察其对乳腺癌细胞株MCF-7的CXCR4表型敲除效应，及其对乳腺癌细胞的生长、趋化和侵袭作用的影响； ④建立在裸鼠体内肿瘤细胞高表达 CXCR4 的乳腺癌动物模型，为后续考察重组腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL 对CXCR4 表型敲除作用和荷瘤小鼠肿瘤的影响奠定基础。 方法： ①采用RT-PCR从人骨髓基质细胞克隆野生型hSDF-1wt基因并进行缺少突变产生 C 端α-螺旋结构域缺失的 hSDF-1α/54 基因，将二者直接插入原核表达载体pET-30a(+)，构建hSDF-1wt和hSDF-1α/54 的原核表达系统后，转化大肠杆菌表达BL21(DE3)，IPTG进行诱导表达。 ②以SDF-WT-PET30a (+)重组质粒为模板，PCR扩增SDF-1α/54基因，并在其C末端引入对应于内质网定位信号序列4肽KDEL的编码基因序列，形成细胞内趋化因子突变体SDF-1α/54/KDEL。随后将其亚克隆至真核克隆/表达质粒pcDNA3.1/Myc-His(-)A 和 pEGFP-C3，构建出两组重组表达质粒：pcDNA3.1/SDF-1α/54/KDEL 和 pEGFP/SDF-1α/54/KDEL。测序正确的重组子经提取质粒和纯化后用脂质体转染 Cos-7 细胞，用 Western blot 鉴定突变体SDF-1α/54/KDEL 的功能性表达，并用激光共聚焦显微镜观察SDF-1/54α/KDEL的融合蛋白在质粒转染后细胞内的定位情况。然后用电穿孔法将经质粒大量提取并纯化的重组体pcDNA3.1/SDF-1α/54/KDEL和pEGFP/SDF-1α/54/KDEL，瞬时转染Molt-4 后，用流式细胞仪(FCM)检测细胞膜表面CXCR4含量的变化。FCM检测转染后 Molt-4 生长情况，趋化性实验检测SDF-1α/54/KDEL转染后对Molt-4表面受体CXCR4的影响。 ③应用PCR的方法制备含 SDF-1α/54/KDEL基因的 DNA 片段，分别双酶切SDF-1α/54/KDEL 和空的穿梭质粒pAdTrack-CMV,再将二者连接，将SDF-1α/54KDEL 亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体，构建成pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL，再利用宿主细菌内同源重组的方法将其与E1缺失的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组，构建成重组腺病毒质粒 Ad-SDF-1α/54/KDEL。鉴定正确后，利用Lipofectamine 2000介导将腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL感染细胞转染293细胞，大约 7 天出现病毒空斑。提取重组感染腺病毒的 293 细胞的 mRNA 进行SDF-1α/54/KDEL基因转录的 RT-PCR 鉴定，并配合 GFP 表达鉴定观察SDF-1α/54/KDEL蛋白的表达。通过细胞传代收获大量扩增的重组腺病毒，测定重组腺病毒的感染复数(MOI)值。体外细胞实验鉴定Ad-SDF-1α/54/KDEL的表型敲除活性：流式细胞仪观察细胞膜 CXCR4 变化情况；MTT法考察Ad-SDF-1α/54/KDEL对乳腺癌细胞 MCF-7 增殖作用的影响；趋化性实验检测Ad-SDF-1α/54/KDEL对MCF-7细胞的趋化活性的影响；明胶酶谱和侵袭实验探索重组腺病毒的Ad-SDF-1α/54/KDEL对MCF-7细胞侵袭的影响。 ④通过裸鼠皮下脂肪垫移植高转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231 建立乳腺癌转移动物模型，检测荷瘤小鼠原发瘤和转移瘤各组织的SDF-1α和CXCR4的表达情况，为考察Ad-SDF-1α/54/KDEL表型敲除CXCR4对乳腺癌的转移的影响作好准备。 结论： ①克隆了出人基质细胞衍生因子-1(hSDF-1)基因，并通过基因缺失突变删除了C末端α螺旋结构域，获得了突变体SDF-1α/54，并构建了其大肠杆菌表达系统。 ②以真核克隆/表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)A和pEGFP-C3为基础构建的两种重组真核表达载体在 Cos-7 细胞表达SDF-1α/54/KDEL，具有在基因水平实施CXCR4表型敲除的功能，并能抑制Molt-4细胞的趋化性且不影响该细胞的生长。表型敲除效率不受SDF-1αC末端α螺旋结构域缺失的影响。其可能机制是：转染后合成的SDF-1α/54/KDEL新蛋白，运至高尔基复合体时由于KDEL的内质网定位作用，新蛋白不会向细胞膜运转而分泌到细胞外，而是滞留于内质网。由于SDF-1α/54/KDEL保留了与 CXCR4 结合的主要结构，仍具备识别和结合 CXCR4受体的能力。SDF-1α/54/KDEL 蛋白便可以在细胞内结合新合成的或内在化的CXCR4 形成复合物，随后被泛素．蛋白酶体等途径降解，从而抑制了受体CXCR4在细胞膜上的表达，达到了表型敲除的效果。 ③重组腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL 能够在乳腺癌细胞株 MCF-7 中感染和表达、滴度高、增殖快、作用高效、毒副作用小，具有对MCF-7 受体CXCR4表型敲除的作用。通过感染乳腺癌MCF-7细胞，表型敲除的效应较重组真核表达载体持续时间长，并能在体外抑制乳腺癌细胞的趋化和侵袭性。其表型敲除机制可能与前述真核表达质粒相同，推测其具有抑制乳腺癌细胞转移的作用。 ④通过裸鼠皮下脂肪垫移植建立的乳腺癌转移动物模型，成功率高，肿瘤保持了人乳腺癌表达CXCR4/SDF-1的活性，可以用于Ad-SDF-1α/54/KDEL体内活性研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略词表

声明

1绪论

1.1研究意义与背景

1.2趋化因子受体CXCR4及其配体SDF-1与乳腺癌的研究现状

1.2.1 CXCR4/SDF-1的构效关系与二者的相互作用

1.2.2 CXCR4/SDF-1在介导乳腺癌等转移的信号传导机制及调节

1.2.3 CXCR4/SDF-1与乳腺癌等肿瘤的发生、发展与预后

1.2.4以CXCR4/SDF-1为靶点的乳腺癌治疗

1.3项目提出

1.4研究目标、研究内容与实施方案

1.4.1研究目标

1.4.2研究内容

1.4.3实施方案

2人基质细胞衍生因子-1突变体SDF-1α/54的克隆及其原核表达系统的构建

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与分析

2.3.1野生型SDF-1α基因(SDF-1wt)成熟肽编码序列的扩增

2.3.2重组质粒pET-30a(+)/SDF-1wt的鉴定

2.3.3 SDF-1突变体SDF-1α/54的PCR扩增

2.3.4突变体重组质粒的鉴定

2.3.5 SDF-1WT及其突变体在BL21(DE3)中的表达

2.3.6 SDF-1WT及其突变体表达产物的Western blot证实

3 SDF-1α/54/KDEL重组真核表达载体的构建及其活性研究

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2方法

3.3结果与分析

3.3.1重组质粒的构建及PCR鉴定

3.3.2脂质体介导的pEGFP/SDF-1α/54/KDEL质粒转染COS-7细胞

3.3.3激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在COS-7细胞中亚细胞定位

3.3.4 SDF-1α/54/KDEL的活性检测

4.SDF-1α/54/KDEL重组腺病毒表达载体的构建及其活性研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2方法

4.3结果与分析

4.3.1 pAdTrack-CMV-SDF-1α/54/KDEL穿梭质粒的构建及鉴定

4.3.2 SDF-1α/54/KDEL重组腺病毒质粒的构建与鉴定

4.3.3重组腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL的包装与扩增

4.3.4重组腺病毒Ad-SDF-1α/54/KDEL的活性分析

5用于SDF-1α/54/KDEL重组腺病毒活性检测的人乳腺癌移植瘤动物模型的建立

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1主要材料

5.2.2方法

5.3结果

5.3.1 MDA-MB-231乳腺癌细胞成瘤情况

5.3.2 MDA-MB-231乳腺癌细胞体内转移率

5.3.3乳腺癌细胞在BALB/C小鼠原位肝脏转移

5.3.4 RT-PCR验证转移组织SDF-1α及CXCR4的表达

5.3.5流式细胞仪检测肿瘤组织中分离的原代细胞CXCR4及HER2表达

5.3.6 MDA-MB-231乳腺癌细胞移植瘤与肝转移的组织学切片

6讨论

6.1 SDF-1α及SDF-1α/54的原核表达系统构建是实行表型敲除的基础

6.2 双真核表达载体构建SDF-1α/54/KDEL初步验证其CXCR4表性敲除功能

6.3腺病毒载体的运用提高了SDF-1α/54/KDEL对MCF-7细胞表型敲除的效率

6.4 Ad-SDF-1α/54/KDEL重组腺病毒对MCF-7细胞活性的分析为研究CXCR4表型敲除抑制乳腺癌的转移机制提供了实验依据

6.5人乳腺癌细胞株移植瘤动物模型建立

7结论、创新性与展望

7.1结论

7.2创新性

7.3展望

致谢

参考文献

附录