Rhodobacter sphaeroides puc2BA的功能及Rhodovulum sulfidophilum pucsBA在Rhodobacter sphaeroides中的异源表达研究

摘要

光合作用是地球上最重要的化学反应。光合细菌是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的微生物,属于能进行光合作用而不产氧的特殊生理类群的原核微生物,广泛存在于自然界。光合细菌光合反应中心是一个由多种色素分子与蛋白质以非共价键方式结合的、具有特定构象的色素-蛋白复合体,光能通过电荷分离及电子转移反应转化为化学能,其效率是当前人工模拟远远不能及的。紫细菌的光合作用结构组装在内陷细胞膜上,它由色素蛋白质组成--光反应中心RC(Reaction Center)和LH(Light Harvesting),LH的功能是捕获光能和转移能量到RC。类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)光合作用单位是由三个光合色素蛋白组成的复合体:RC、LHI、LHII,它们在细菌体内共同作用捕获光能。LHII处于捕光结构的最外层,是最重要的捕光蛋白,已经证实是由puc1BA基因编码的两个低分子量脱辅基蛋白(α和β),与非共价键结合的细菌叶绿素(BChl)和类胡萝卜素相互结合构成了一个完整的复合物。在以R. sphaeroides puc1BA为探针的Northern分析中,发现其基因组中存在与puc1BA的相似序列,但对其表达调控、功能和作用尚不清楚。本研究利用分子生物学和光谱分析的方法,克隆puc1BA的相似序列基因puc2BA,并与puc1BA相互交叉构建于带有puc启动子的pRK415表达载体上,通过接合转移把表达质粒导入R. sphaeroides突变体DD13中,分析其表达特性,以及puc1BA、puc2BA在R. sphaeroides中的表达特点和关系,初步明确了R. sphaeroides基因组中同源基因puc2BA的表达特点和功能。对来自于不同属、亲缘关系较远、生理特性差异很大的嗜硫小红卵菌(Rhodovulum. sulfidophilum),克隆其pucsBA基因,并与R. sphaeroides pufBA同时构建于pRK415表达载体上进行表达,分析异源捕光蛋白的Rdv. sulfidophilum pucsBA基因在R. sphaeroides的表达和功能,以及与R. sphaeroides中LHI的关系。通过实验和分析,我们初步得到以下结论:1、R. sphaeroides的puc2BA在R. sphaeroides中能够正常表达,能够形成LHII,但必需有pucC的表达和参与。2、R. sphaeroides的puc2BA的表达量比puc1BA要低得多,只有后者的19.60％。通过半定量RT-PCR分析,在基因组中puc2BA的转录水平比puc1BA的转录水平要低。在表达质粒上转录水平基本无差异,但是形成的LHII差异明显,在组装LHII的效率上,来源于puc2BA的蛋白亚基明显低于来源于puc1BA的蛋白亚基,前者形成的LHII仅仅是一个重要的补充。3、R. sphaeroides的puc2BA与puc1BA交叉配合,能够正常表达。4、Rdv. sulfidophilum pucsBA基因在R. sphaeroides中能够正常表达,但表达量略低,是R. sphaeroides puc1BA的70.13%。5、Rdv. sulfidophilum pucsBA与R. sphaeroides pufBA能够同时在R. sphaeroides中表达,能形成异源的LHII与其自已的LHI。本研究的结果有助于分析基因组中同源基因的表达特性,以及其自身进化过程中所呈现出的其特有的表达和调控机制,物种的基因组结构和功能的关系。Rdv. sulfidophilum异源膜蛋白LHII的正常表达有助于理解它们的进化关系及其晶体结构研究。本研究有助于我们理解光合细菌捕获太阳能的分子机理,为我们充分利用太阳能提供一定的理论依据。异源膜蛋白的正常表达,为进一步表达其它功能膜蛋白提供了一定的实验依据。

目录

摘要

ABSTRACT

1 绪论

1.1 研究背景

1.1.1 光合细菌概况

1.1.2 紫色光合细菌的光反应结构

1.1.3 紫色光合细菌捕获光能的作用机理

1.1.4 捕光蛋白分子及核酸研究

1.1.5 捕光蛋白的蛋白晶体结构研究

1.1.6 LHII 同源基因的表达研究

1.2 研究目的和意义

1.3 研究目标和整体设计

1.3.1 研究目标

1.3.2 整体研究思路构架

1.4 研究内容和技术路线

1.4.1 R. sphaeroides 的puc2B, puc2A-1, puc2A-2 基因克隆

1.4.2 puc2BA 与puc1BA 基因超表达载体的构建

1.4.3 puc2BA 与puc1BA 的相互表达关系

1.4.4 突变puc2B 的表达特性

1.4.5 Rdv. sulfidophilum pucsBA 的基因克隆及表达分析

1.4.6 Rdv. sulfidophilum pucsBA 与R. sphaeroides pufBA 的关系

1.5 本研究的创新性

2 材料和方法

2.1 R. sphaeroides puc1BA 同源基因的克隆

2.1.1 试验菌株与质粒

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3 主要试剂

2.1.4 R. sphaeroides DD13 总DNA 的提取

2.1.5 R. sphaeroides puc1B 同源基因 puc2B 的 PCR 扩增、克隆及测序

2.1.6 R. sphaeroides puc1A 同源片段puc2A-1 的PCR 扩增、克隆及测序

2.1.7 R. sphaeroides puc1A 同源基因puc2A-2 的PCR 扩增、克隆及测序

2.1.8 随机易错PCR 扩增、克隆puc2B 及测序

2.2 同源 puc 基因超表达载体的构建

2.2.1 试验菌株与质粒

2.2.2 主要仪器设备

2.2.3 主要试剂

2.2.4 pRK 系列超表达载体筛选引物设计

2.2.5 pRK2B1AC 超表达载体的构建

2.2.6 pRK1B2B1AC 超表达载体的构建

2.2.7 pRK1B2A-1C 超表达载体的构建

2.2.8 pRK1B2A-2C 超表达载体的构建

2.2.9 pRK2B2A-1C 超表达载体的构建

2.2.10 pRK2B2A-2C 超表达载体的构建

2.2.11 pRK2Bt1AC 超表达载体的构建

2.3 接合转移将超表达载体导入 R. sphaeroides DD13

2.3.1 试验菌株和质粒

2.3.2 主要仪器设备

2.3.3 主要试剂

2.3.4 S17-1 感受态细胞的制备和转化

2.3.5 接合转移

2.3.6 稳定转化子的筛选

2.4 R. sphaeroides DD13 转化结合子的表达分析

2.4.1 试验菌株

2.4.2 主要仪器设备

2.4.3 主要试剂

2.4.4 R. sphaeroides DD13 转化结合子的培养

2.4.5 R. sphaeroides DD13 转化结合子的诱导表达

2.4.6 R. sphaeroides DD13 转化结合子的光谱分析

2.4.7 R. sphaeroides DD13 转化结合子膜蛋白的提取及含量测定

2.4.8 R. sphaeroides DD13 转化结合子膜蛋白的光谱分析

2.4.9 三种转化结合子的吸收光谱比较及LHII 含量测定

2.4.10 半定量RT-PCR 引物设计及RNA 提取

2.4.11 半定量RT-PCR 分析

2.4.12 三种转化结合子的细菌叶绿素含量测定

2.4.13 DD13-pRK1B2A-1C 和DD13-pRK1B2A-2C 的LHII 的提取纯化

2.5 Rdv. sulfidophilum pucsBA 基因在 R. sphaeroides 中的表达特性

2.5.1 试验菌株和质粒

2.5.2 主要仪器设备

2.5.3 主要试剂

2.5.4 Rdv. sulfidophilum pucsBA 基因的PCR 扩增、克隆及测序

2.5.5 R. sphaeroides pufBA 基因的PCR 扩增、克隆及测序

2.5.6 pucsBA 基因超表达载体的构建

2.5.7 接合转移将超表达载体导入 R. sphaeroides DD13

2.5.8 Rdv. sulfidophilum pucsBA 基因的表达分析

2.5.9 Rdv. sulfidophilum pucsBA 与R. sphaeroides pufBA 的关系

2.5.10 DD13-pRKsBA 与DD13-pRKpucP*1B1AC 的细菌叶绿素含量比较

2.6 R. sphaeroides puc2BA 及 Rdv. sulfidophilum pucsBA 的结构预测

2.6.1 R. sphaeroides puc1BA 和puc2BA 的结构预测

2.6.2 Rdv. sulfidophilum pucsBA 的结构预测

2.6.3 R. sphaeroides puc2A 和 Rdv. sulfidophilum pucsA 的跨膜结构预测

3 结果与分析

3.1 R. sphaeroides puc1BA 同源基因的克隆和分析

3.1.1 R. sphaeroides puc2B 基因的克隆及序列分析

3.1.2 R. sphaeroides puc2A-1 基因的克隆及序列分析

3.1.3 R. sphaeroides puc2A-2 基因的克隆及序列分析

3.1.4 R. sphaeroides 突变puc2B 基因的克隆及序列分析

3.2 R. sphaeroides puc 基因超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.2.1 pRK2B1AC 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.2.2 pRK1B2B1AC 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.2.3 pRK1B2A-1C 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.2.4 pRK1B2A-2C 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.2.5 pRK2B2A-1C 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.2.6 pRK2B2A-2C 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.2.7 pRK2Bt1AC 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.3 DD13 超表达稳定转化结合子的筛选和鉴定

3.3.1 超表达载体转化S17-1 的阳性克隆筛选

3.3.2 超表达稳定转化结合子的筛选

3.4 转化结合子的表达特性分析

3.4.1 转化结合子的培养及诱导表达

3.4.2 R. sphaeroides DD13 转化结合子的光谱特性

3.4.3 R. sphaeroides DD13 转化结合子LHII 的光谱特性

3.4.4 puc2BA 与puc1BA 的表达特性比较

3.4.5 三种转化结合子细菌叶绿素含量比较

3.4.6 半定量RT-PCR 分析puc2BA 与puc1BA 的表达特性

3.4.7 DD13-pRK1B2A-1C 和DD13-pRK1B2A-2C 的LHII 纯化及SDS-PAGE电泳

3.5 Rdv. sulfidophilum pucsBA 基因在 R. sphaeroides 中的表达和分析

3.5.1 Rdv. sulfidophilum pucsBA 基因的扩增、测序及序列分析

3.5.2 R. sphaeroides pufBA 基因的PCR 扩增、测序及序列分析

3.5.3 pRKsBAC 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.5.4 pRKpufBAsBAC 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.5.5 pRKpufBA1B1AC 超表达载体的构建、筛选和鉴定

3.5.6 转化结合子的筛选及鉴定

3.5.7 Rdv. sulfidophilum pucsBA 基因的表达

3.5.8 Rdv. sulfidophilum pucsBA 与R. sphaeroides pufBA 的表达关系

3.5.9 Rdv. sulfidophilum pucsBA 与R. sphaeroides puc1BA 的表达特性比较

3.6 R. sphaeroides puc2BA 及 Rdv. sulfidophilum pucsBA 的结构预测分析

3.6.1 R. sphaeroides puc2BA 的结构预测分析

3.6.2 Rdv. sulfidophilum pucsBA 的结构预测分析

3.6.3 R. sphaeroides puc2A 和 Rdv. sulfidophilum pucsA 的跨膜结构预测分析

4 讨论

4.1 R. sphaeroides 同源基因 puc2BA 的功能分析

4.2 R. sphaeroides 中 puc1BA 与同源基因 puc2BA 的表达关系

4.3 Rdv. sulfidophilum pucsBA 基因在 R. sphaeroides 中的功能

4.4 Rdv. sulfidophilum pucsBA 基因与 R. sphaeroides pufBA 基因的表达关系

4.5 异源膜蛋白在 R. sphaeroides 中的表达

5 结论

致谢

参考文献

附录