纳秒脉冲电场诱导肿瘤凋亡的窗口效应与实验研究

摘要

恶性肿瘤严重威胁人类生命健康，传统的治疗手段由于受其适应症、禁忌症和副作用等因素的限制，对恶性肿瘤的疗效仍不够理想。传统肿瘤治疗方法的机理在于杀伤肿瘤细胞并抑制其生长与增殖，因而只能延缓肿瘤的进展，不能达到治愈的目的。而诱导肿瘤细胞凋亡能使肿瘤组织缩小甚至消失，并减少对正常细胞的损害和治疗过程中的不良反应，因此，研究诱导肿瘤细胞凋亡的方法与机制，对于肿瘤治疗有着特别重要的意义。
　　 为此，本文在传统电疗法的基础上，通过阐述各种参数脉冲电场的生物电效应共性基础理论，深入研究纳秒脉冲电场诱导肿瘤凋亡的方法和机制，取得的主要成果有：
　　 ①分别建立了球形细胞的多层介电模型、等效电路模型和场一路复合模型，提出了各种模型内外膜跨膜电位的计算方法，分析了内外膜跨膜电位对全时/频段(微秒-纳秒-皮秒)范围内脉冲电场的响应规律，从而提出了脉冲电场的脉宽-场强脉冲参数窗口效应和电导率-介电常数细胞电参数窗口效应。
　　 ②以传统脉冲功率技术中的电容充放电为基本原理，结合高压大功率电力电子开关及其触发技术、基于数字电位器和线性光耦的程控调压技术，研制出了一套高场强纳秒脉冲肿瘤治疗仪样机，该样机稳定可靠，并能对输出指数衰减纳秒脉冲的电压峰值(0～25kV)、脉冲宽度(100ns～1μs)、重复频率(1～100Hz)和脉冲个数等参数进行独立、精确控制。
　　 ③以离体人浆液囊腺性卵巢癌SKOV3肿瘤细胞为对象，采用场强10kV/cm、脉宽100ns的高场强纳秒脉冲电场进行处理，通过流式细胞术检测、扫描电子显微镜观察、透射电子显微镜观察、AO(吖啶橙)/EB(溴化乙啶)荧光检测、细胞内钙离子浓度检测等手段，证实了纳秒脉冲电场能有效诱导离体肿瘤细胞凋亡，其机制是通过激活细胞内钙库(内质网、线粒体)，引起细胞内钙离子浓度升高，从而介导凋亡信号通路。
　　 ④以接种人黑色素瘤细胞A375的BALB/C裸鼠为对象，采用场强20kV/cm、脉宽300ns的高场强纳秒脉冲电场进行处理，通过抑瘤效应观察、透射电子显微镜观察、免疫荧光染色检测Caspase-3蛋白表达、RT-PCR检测Caspase-3 mRNA表达、TUNEL原位末端标记DNA降解等手段，证实了纳秒脉冲电场能有效诱导在体肿瘤凋亡并有效抑制其生长，其机制是通过激活肿瘤细胞Caspase-3蛋白酶而诱导肿瘤细胞调亡，从而使肿瘤组织缩小甚至消失。
　　 综上所述，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的最新研究热点和可能突破口，而纳秒脉冲电场能有效诱导肿瘤细胞凋亡并明显抑制在体肿瘤组织的生长，在局部肿瘤治疗领域显示出良好的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1引言

1.1.1肿瘤及其危害

1.1.2肿瘤的传统治疗方法

1.2脉冲电场治疗肿瘤的国内外研究现状

1.2.1毫微秒脉冲可逆性电穿孔治疗肿瘤的国内外研究现状

1.2.2微秒脉冲不可逆性电穿孔治疗肿瘤的国内外研究现状

1.2.3纳秒脉冲电场诱导凋亡治疗肿瘤的国内外研究现状

1.2.4脉冲电场治疗肿瘤机理的国内外研究现状

1.3脉冲电场治疗肿瘤存在的问题

1.4本文的主要工作

1.5本章小结

2脉冲电场治疗肿瘤的窗口效应

2.1引言

2.2基于电场模型的窗口效应

2.2.1球形单细胞多层介电模型的建立

2.2.2细胞内外膜跨膜电位频率特性计算方法

2.2.3仿真计算结果及其滤波器特性分析

2.3基于电路模型的窗口效应

2.3.1细胞等效电路模型的建立

2.3.2细胞内外膜跨膜电位频率响应的计算

2.3.3细胞内外膜跨膜电位的滤波器特性分析

2.3.4细胞内外膜跨膜电位频率响应的PSpice仿真

2.4基于场—路复合模型的窗口效应

2.4.1细胞场—路复合模型的建立

2.4.2细胞外膜跨膜电位的传递函数

2.4.3细胞内膜跨膜电位的传递函数

2.4.4细胞内外膜跨膜电位的时域特性分析

2.4.5细胞内外膜跨膜电位的频率特性分析

2.4.6场—路复合模型与电场模型、电路模型的比较分析

2.5脉冲电场治疗肿瘤的窗口效应

2.5.1脉宽-场强-跨膜电位窗口效应

2.5.2脉宽-场强-生物医学效应窗口关系

2.5.3细胞电参数对内外膜跨膜电位的窗口效应

2.6本章小结

3纳秒脉冲电场肿瘤治疗仪的研制

3.1引言

3.2纳秒脉冲电场肿瘤治疗仪的原理

3.2.1高压纳秒脉冲发生器的实现方式

3.2.2高压纳秒脉冲发生器的总体原理

3.2.3杂散参数影响输出波形的理论分析

3.2.4杂散参数影响输出波形的仿真分析

3.3纳秒脉冲电场肿瘤治疗仪的设计

3.3.1主电路的设计

3.3.2氢闸流管触发电路的设计

3.3.3计算机程控调压方法设计

3.4装置的实验室调试

3.5本章小结

4纳秒脉冲电场诱导离体人卵巢癌细胞SKOV3凋亡的实验研究

4.1引言

4.1.1细胞凋亡与细胞坏死

4.1.2细胞凋亡的调节机制

4.1.3细胞凋亡的信号通路

4.1.4凋亡诱导与肿瘤治疗

4.1.5细胞凋亡的检测方法

4.2医学细胞实验用电极的设计

4.3纳秒脉冲电场诱导凋亡窗口效应的细胞实验

4.3.1实验方法

4.3.2实验结果

4.4纳秒脉冲电场诱导人卵巢腺癌细胞凋亡

4.4.1细胞培养

4.4.2纳秒脉冲电场处理

4.4.3 MTT法检测细胞存活率

4.4.4 AO/EB荧光检测细胞凋亡

4.4.5透射电子显微镜观察细胞超微结构变化

4.4.6扫描电子显微镜观察细胞膜变化

4.4.7流式细胞术检测细胞凋亡率

4.4.8激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度变化

4.4.9 CaCl2对肿瘤细胞内钙离子浓度的影响

4.5纳秒脉冲电场诱导肿癌细胞凋亡的机制

4.5.1细胞凋亡的钙离子调控机制

4.5.2纳秒脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的钙离子调控机制

4.6细胞溶液的温度升高

4.6.1细胞生长与环境温度

4.6.2细胞凋亡与环境温度

4.6.3纳秒脉冲电场作用下细胞溶液的温度升高

4.7本章小结

5纳秒脉冲电场诱导荷瘤BALB/C裸鼠在体肿瘤凋亡的实验研究

5.1引言

5.2医学动物实验用电极的设计

5.3纳秒脉冲电场诱导荷瘤BALB/C裸鼠凋亡

5.3.1细胞培养

5.3.2动物模型的建立

5.3.3纳秒脉冲电场处理

5.3.4抑瘤效应观察

5.3.5透射电子显微镜观察

5.3.6免疫荧光染色检测Caspase-3蛋白表达

5.3.7 RT-PCR检测Caspase-3 mRNA表达

5.3.8 TUNEL原位末端标记DNA降解

5.4纳秒脉冲电场诱导在体肿瘤凋亡的机制

5.4.1细胞凋亡的Caspase调控机制

5.4.2纳秒脉冲电场诱导肿瘤细胞凋亡的Caspase-3调控机制

5.5纳秒脉冲电场作用下组织温度场分布的仿真

5.5.1生物组织传热的理论模型

5.5.2仿真模型

5.5.3仿真结果

5.6本章小结

6结论与展望

6.1主要结论

6.2后续工作展望

致谢

参考文献

附录