绿僵菌侵染相关基因Magas1的克隆和功能分析

摘要

绿僵菌(Metarhiziumacridum)属于半知菌亚门绿僵菌属，是一种致病力强的昆虫病原真菌，具有对人、畜、农作物等无毒，无残毒、菌剂易生产及持效期长等优点，具有广阔的应用前景。附着胞是昆虫病原真菌重要的侵染结构，在绿僵菌成功侵染寄主一系列复杂的过程中，孢子萌发并分化形成附着胞是关键。
　　本实验室已构建了绿僵菌在附着胞形成阶段的均一化cDNA文库，本研究从该文库中挑选了一个附着胞期间特异表达的基因Magas1，克隆了该基因的全长cDNA序列(GenBank登陆号：DQ496227)，生物信息学分析显示该基因编码317个氨基酸，含有954bpORF框，同源性分析结果表明，Magas1编码的蛋白质与Aspergillusfumigatus中的mas1(XP747144)及Magnaporthegrisea中的gas2(AF26-4035)等均有很高的同源性。
　　半定量RT-PCR分析结果显示该基因在附着胞期间表达量最高，在孢子萌发初期及菌丝时期亦有低水平的表达，在其它时期如体内菌丝时期、培养基上产孢时期及虫体体表产孢时期几乎不表达。
　　以Magas1基因的启动子构建的Magas1-EGFP融合表达载体，通过激光共聚焦显微镜检测发现到绿色荧光融合蛋白定位于附着胞的细胞质。
　　将该基因敲除后，与野生型相比，Magas1基因突变株在1/4SDAY培养基上产孢结构生成延迟，而两者在孢子萌发率及附着胞形成率上并无显著差异。毒力测试结果表明突变菌株对东亚飞蝗的毒力比野生型显著下降，说明Magas1是绿僵菌的一个毒力因子，而突变菌株膨胀压下降表明影响真菌穿透寄主体表。对该基因的深入研究有助于了解昆虫病原真菌的形成及侵入机理。

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1 绪 论

1.1 研究背景与意义

1.2 绿僵菌的研究现状

1.3 附着胞的研究进展

1.4 立题依据和研究目标

1.5 研究内容和技术路线

1.6 本研究创新之处

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 Magas1全长cDNA基因的克隆及相关序列分析

2.3 Magas1基因表达谱分析

2.4 Magas1基因表达定位分析

2.5 Magas1基因敲除突变菌株的筛选

2.6 Magas1基因功能的研究

3 结果和分析

3.1 Magas1基因cDNA全长的克隆及序列分析

3.2 Magas1基因表达时期分析

3.3 Magas1基因表达定位分析

3.4 Magas1敲除突变株的筛选

3.5 Magas1的基因功能研究

4 讨论

4.1 筛选cDNA 文库的方法获取Magas1基因的cDNA全长

4.2 Magas1表达时期及表达定位分析

4.3 Magas1的功能分析

5 结论与后续工作建议

致谢

参考文献

附 录