基于基因表达系列分析技术评价聚(D,L-乳酸)改性材料生物相容性的研究

摘要

生物材料的生物相容性评价对生物材料的研究具有重要的指导意义。为了全面分析评价生物材料的生物相容性,近年来许多研究都集中在生物材料与机体相互作用的机理研究上,其中尤以在分子水平探讨生物材料与机体相互作用的机理是国内外研究的一大热点。本研究利用先进的基因表达系列分析(SAGE)技术,从转录组水平全面分析生物材料与机体相互作用的机制,建立一种全新的评价生物材料生物相容性的方法。
　　 聚乳酸是一种具有优良的生物相容性和生物降解性的高分子医用生物材料。为了克服聚乳酸的临床使用缺点和提高其亲水性及细胞亲和性,本研究采用马来酸酐(MAH)对聚(D,L-乳酸)(PDLLA)进行化学改性制备一种新型的马来酸酐改性聚(D,L-乳酸)(MPLA)材料,考察了MPLA和PDLLA材料亲/疏水性和材料表面形貌,并对MPLA和PDLLA材料的细胞生物相容性进行评价。同时,采用LongSAGE方法,构建了在MPLA和PDLLA材料上MC3T3-E1成骨细胞的LongSAGE文库,并对MPLA和PDLLA材料调控的差异表达的基因进行GO分析和KEGG通路分析,从分子水平探索MPLA材料与细胞相互作用的分子机制,评价其分子生物相容性。主要研究内容和结论如下:
　　 (1)采用静态水接触角和吸水率方法检测MPLA和PDLLA材料亲/疏水性,同时采用原子力显微镜对MPLA和PDLLA材料表面形貌进行观察。
　　 ①亲/疏水性研究结果表明,MPLA材料的水接触角小于PDLLA材料的水接触角,而MPLA材料的吸水率大于PDLLA材料的吸水率,这说明MPLA材料的亲水性优于PDLLA材料。
　　 ②表面形貌研究结果表明,PDLLA和MPLA材料表面形貌基本相似。
　　 (2)从细胞形态学、细胞粘附和铺展、细胞骨架、细胞增殖、以及细胞分化和矿化等几个方面,对PDLLA和MPIA材料进行了细胞生物相容性的评价。
　　 ①细胞形态学实验的结果表明,MPLA材料有利于成骨细胞早期的附着和粘附,而并不影响该细胞正常的形态；
　　 ②细胞粘附和铺展实验的结果表明,MPLA材料对细胞的粘附较强,细胞粘附后铺展的面积也较大;PDLLA材料对细胞的粘附较弱,细胞的铺展面积也相应较小；可见MPLA材料对细胞粘附和铺展有促进作用；
　　 ③细胞增殖和细胞周期实验的结果表明,MPLA材料上成骨细胞具有较高的增殖活力,在接种初期增殖速率较快,可见MPLA材料对成骨细胞的增殖有促进作用；
　　 ④细胞分化和矿化实验的结果表明,MPLA材料上成骨细胞的ALP活性以及分泌的无机钙含量都显著性高于PDLLA组和对照组,可见MPLA材料对成骨细胞的分化和矿化也有促进作用。这些结果提示,MPLA材料比PDLLA材料具有更好的细胞生物相容性。
　　 (3)采用LongSAGE技术,构建了在MPLA和PDLLA材料上MC3T3-E1成骨细胞的LongSAGE文库,为生物材料的生物相容性评价提供了一个新方法。
　　 (4)采用SAGE2000软件和SAGEmap数据库,对MPLA和PDLLA材料作用的MC3T3-E1成骨细胞的LongSAGE文库进行分析研究。
　　 ①建立了PDLLA和MPLA两个LongSAGE文库,共获得38484个标签。PDLLA文库标签为19438个,特异性标签为6964种。而MPLA文库标签为19046个,特异性标签7205种。结果显示,PDLLA和MPLA两个文库中标签匹配情况和丰度分布情况都基本相同,表明两者的标签数据具有可靠性和可比较性。
　　 ②相对于PDLLA文库,MPIA文库中共有202个显著性差异表达的标签,其中上调表达的标签有92个,而下调表达的标签有110个。结果显示,MPLA材料都能有效地调节成骨细胞基因的表达。
　　 ③实时定量PCR检测结果显示,选择的8个差异表达的基因(Aktls1、Calm1、Cdkn1a、Cf11、Fn1、Hdac1、Hdae5和Mt2)的差异表达的情况与LongSAGE实验结果基本一致,验证了LongSAGE实验结果的可靠性。
　　 这些结果提示,与PDLLA相比,MPIA材料中引入-COOH活性基团,其化学结构的变化能调控成骨细胞基因的差异表达。
　　 (5)采用GoSurfer软件和KEGG数据库,对PDLLA和MPLA材料作用的MC3T3-E1成骨细胞的LongSAGE文库中筛选出的差异表达基因进行GO分析和通路分析研究,以及对其分子机制进行探讨。
　　 ①生物学过程的GO分析结果显示,MPLA材料调控的差异表达基因主要富集的功能分类为细胞生理过程、细胞通讯、细胞过程的调控、细胞分化、代谢、定位、应激反应及形态学等；
　　 ②分子功能的GO分析结果显示,MPLA材料调控的差异表达基因主要富集的功能分类为蛋白质结合、核酸结合、离子结合、核苷酸结合、转运子活性、离子运输活性、水解酶活性、氧化还原酶活性及转移酶活性等；
　　 ③细胞组分的GO分析结果显示,MPLA材料调控的差异表达基因主要富集的功能分类为细胞内、膜、细胞内器官、核蛋白复合体、质子运输ATP酶复合体、质子运输ATP合成酶复合体以及转录因子复合体等；
　　 ④MPLA材料调控的上调基因主要参与调控了细胞增殖、细胞周期、细胞骨架的组成、细胞激活、骨形成以及骨重建等生物学途径;MPLA材料调控的下调基因主要参与调控细胞死亡、负调控凋亡、染色质的修饰、细胞生理途径、代谢途径、以及生物合成等生物学途径；
　　 ⑤KEGG通路分析结果表明,MPLA材料调控的差异表达基因主要参与调控了核糖体蛋白通路、氧化磷酸化通路、细胞周期通路、肌动蛋白细胞骨架通路、蛋白酶体通路及溶酶体通路等。
　　 (6)MPLA材料与成骨细胞相互作用的分子机制总结如下:
　　 ①由于MPLA材料表面的亲水性的-COOH基团,通过调控了细胞的肌动蛋白骨架调节通路及相关基因的表达,有利于细胞早期的粘附和铺展；
　　 ②MPLA材料作用后,通过调控核糖体通路,上调了核糖体蛋白基因的表达,促进核糖体蛋白的合成,同时增强细胞内DNA合成和细胞分裂,促进了细胞的生长和增殖；
　　 ③MPLA材料作用后,通过调控氧化磷酸化通路,增加细胞的氧化磷酸化水平,增强细胞内的能量代谢；
　　 ④MPLA材料通过调控蛋白酶体通路和溶酶体通路,有利于细胞的DNA损伤的自身修复和防御功能,同时调控细胞周期通路和P21基因表达,防止细胞过度增殖和细胞凋亡；
　　 ⑤MPLA材料作用后,抑制Hdac1和Hdac5基因的表达,增强了细胞的转录活性,促进碱性磷酸酶和无机钙的合成,促进成骨细胞的分化。
　　 上述结果提示,MPLA材料比PDLLA材料具有更好的生物相容性。