CML24在拟南芥主根机械响应中的作用

摘要

植物的根在土壤中生长时会遭遇到不同类型的机械刺激，如：土壤颗粒的侧向压力与摩擦、岩石等物理障碍的阻挡、重力等。准确的感受这些机械刺激并做出合理的响应是植物对局部土壤环境适应并生存的基础。
　　 过去的研究表明，机械刺激对拟南芥大量基因的表达具有显著影响。这些基因包括最初发现的4个拟南芥接触诱导基因(TCH基因)。其中TCH1～3基因编码钙调蛋白和钙调蛋白类似蛋白，它们的发现及分子身份的确定表明钙信号及潜在的钙信号受体蛋白可能在拟南芥机械响应中发挥作用。最近的研究证实钙信号是拟南芥复杂机械信号转导过程的上游作用因子。但是，TCH1～3是否在拟南芥的机械响应中发挥功能、发挥什么功能仍不清楚。本文基于反向遗传学思路，通过观测并比较野生型(Col-0)与突变信息明确的TCH1～3基因突变体主根在器官、细胞及亚细胞水平的机械响应行为的差异，探索TCH1～3基因在拟南芥主根机械响应中的可能功能。研究结果表明，TCH2(又名CML24)的正常功能是拟南芥主根正常机械响应的必要条件，并且其功能很可能通过调控皮层微管的排布趋向实现。这为CML24在拟南芥机械响应中发挥功能的假设提供了直接的实验证据，也为以后CML24功能的完整阐明提供了宝贵的线索，是对现有的钙通信在植物机械响应中作用理解的重要补充。本文主要研究内容如下：
　　 由于向重性生长的驱使，拟南芥根尖在向后倾斜的琼脂表面受到持续的机械接触刺激。因此，本文首先通过观测并比较野生型(Col-0)与TCH1～3基因突变体主根在琼脂表面的生长行为，筛选在主根机械响应中具有潜在功能的TCH基因。研究发现，所测TCH1～3基因突变体都表现出正常的波形生长及向重性生长，只有CML24基因的两个点突变体cml24-2与cml24-4的主根表现出相对于野生型主根显著的、趋向性的偏斜生长及外表皮细胞系螺旋表型，并且其主根长度也显著小于野生型。此外，cml24-2与cml24-4主根的趋向性的偏斜生长及外表皮细胞系螺旋表型具有琼脂表面接触依赖性。这些结果表明，cml24突变体主根可能存在接触响应缺陷。
　　 cml24突变体主根的偏斜生长和外表皮细胞系螺旋表型与文献报道的微管相关突变体的主根在相同培养条件下的表型十分相似。通过在琼脂培养基中添加不同浓度的微管药物，我们发现在偏斜生长和外表皮细胞系螺旋方面，cml24突变体与野生型对微管特异药物的敏感性存在差异。这提示CML24可能具有微管相关功能。对GFP-MBD/cml24纯合子主根的琼脂表面生长行为观测为这种可能性提供了遗传学证据。GFP-MBD转基因与cml24突变对主根的琼脂表面生长行为的影响表现出非累加效应。此外，对微管骨架的活体观测显示，GFP-MBD(Col-0)与GFP-MBD/cml24-4主根伸长区外表皮细胞的皮层微管排布趋向存在差异，并且这种差异同样具有琼脂表面接触依赖性，不出现于液体培养环境中。这表明，CML24很可能通过调控皮层微管排布趋向在拟南芥主根的接触响应中发挥功能。
　　 不同琼脂含量培养基层的叠加与玻璃障碍的插入是模拟自然环境中土壤贯入阻力变化的有效手段。因此，为了进一步验证cml24突变体主根的接触响应缺陷及CML24基因突变对主根机械相关生理功能的影响，我们对野生型和cml24突变体主根进行了硬琼脂层穿透和玻璃障碍响应测试。研究发现，cml24突变体主根从较软琼脂层到较硬琼脂层的穿透比例显著小于野生型。这表明，cml24突变体主根对生长环境贯入阻力的增加比野生型更加敏感。此外，没有穿透的cml24突变体主根在较硬琼脂层的界面处出现趋向性盘旋生长，而没有穿透的野生型主根却在较硬琼脂层的界面处进行波形蔓延生长；cml24突变体主根在遭遇生长路径前方的玻璃障碍时也不能形成野生型典型的‘阶梯形’生长响应。这些结果说明，CML24的正常功能在拟南芥主根对土壤机械环境变化的适应中具有重要意义。
　　 基于CML24作为钙信号潜在受体的假设，我们对野生型与cml24突变体主根中机械弯曲诱导的钙信号模式进行了实时定量观测，并发现机械弯曲可以在YC3.6/cml24纯合子主根中诱导类似于YC3.6(Col-0)中的双峰型钙信号。这一观测结果支持“CML24在拟南芥机械响应中的功能主要处于钙信号下游”的经典假设。不过，我们还发现YC3.6/cml24-2主根的静息态胞质钙离子浓度高于YC3.6，YC3.6/cml24-2与YC3.6/cml24-4主根中弯曲诱导的第二峰钙信号都较YC3.6持续的时间更长，YC3.6/cml24-4主根中弯曲诱导的第二峰钙信号的相对增加幅度也高于YC3.6。因此，CML24还可能在胞质钙离子动态平衡调控中发挥功能。