番茄SI-FIL1转录激活域EPR1的鉴定及其磷酸化对转录调控功能的影响研究

摘要

乙烯是一种重要的植物激素，在植物的生长发育过程中起着重要调控作用。植物在种子萌发、侧根发育、茎生长、果实发育成熟、器官的衰老脱落等生命活动中存在着各种乙烯应答反应。研究表明，植物中有几百个基因受到乙烯的调控。对拟南芥以及番茄乙烯突变体的大量研究表明，乙烯应答反应存在明显的时空特异性，相同的乙烯浓度在植物不同的组织或不同的发育阶段会引起完全不同的乙烯应答反应。
　　 EIN3/EILs(Ethylene-Insensitive3，EIN3；EIN3-Like，EIL)蛋白家族是乙烯信号通路中一个重要的正调控因子。EIN3/EILs存在于细胞核，作为一种转录因子能与乙烯应答基因启动子的特异序列结合，并激活基因的转录。EIN3/EILs蛋白能直接调控ERF(Ethylene Response Factor)基因家族的转录，研究者推测EIN3/EILs蛋白家族通过调控不同的ERF基因从而引起各类具有时空特异性的乙烯应答反应。然而，EIN3/EILs是一个较小的蛋白家族，已知在拟南芥中存在四种EIN3/EILs蛋白，在番茄中也仅存在四种EIN3/EILs蛋白。研究表明EIN3/EILs蛋白存在功能冗余，并且EIN3/EILs基因的转录并不受乙烯调控。那么，EIN3/EILs蛋白家族是如何响应乙烯信号并调控下游数量庞大的乙烯应答基因而最终引起多样化的乙烯应答反应呢?对此目前尚无任何报道。因此，深入研究EIN3/EILs蛋白家族的转录调控机理将有助于阐明乙烯应答反应调控过程。研究结果具有重要的理论意义。
　　 磷酸化修饰对转录因子转录活性的调节作用已得到广泛的认同。在前期研究中，我们发现番茄S1-EIL1蛋白质的转录调控功能受到磷酸化的调控。本研究中，在Sl-EIL1中分析鉴定了EPR1磷酸化功能域，并通过瞬时表达荧光检测、BiFC(Bimolecular fluorescence complementation)以及转基因分析等技术对EPR1功能进行了深入研究，分析了EPR1磷酸化在Sl-EIL1转录调控过程中的作用机理，并初步建立了EIN3/EILs蛋白起始转录调控模式。主要研究结果与结论如下：
　　 (1)EPR1功能域的预测与分析。采用Group-based Prediction system(GPS2.1)软件预测分析了EIN3/EILs蛋白家族高度保守区域内的磷酸化位点，结合ExASy在线PROSITE分析软件，对所预测的8个保守磷酸化位点进行进一步的分析鉴定。推测在EIN3/EILs蛋白的DNA结合功能域的N端存在一个谷氨酰胺富集区(Q-richdomain)，并具有一个高度保守的PKA磷酸化位点，该区域具有明显的转录激活功能域特点，我们将它命名为EIN3/EILs-phosphorylation region1(EPR1)。
　　 (2)EPR1功能域对SL-EIL1转录调控功能的影响。对Sl-EIL1的EPR1碱基位点进行PCR位点突变，获得突变基因Sl-EM1和Sl-EM2(Sl-EIL1-mutant1 andSl-EIL1-mutant2)。采用原生质体转化瞬时表达技术以及转基因分析等方法，对Sl-EIL1、Sl-EM1和Sl-EM2的功能进行分析比较，确认EPR1功能域对Sl-EIL1的转录调控功能有着密切的影响。
　　 (3)EPR1功能域作用机理的研究。采用BiFC技术分析比较了Sl-EIL1、Sl-EM1和Sl-EM2的二聚化及异聚化活性，发现EPR1功能域对Sl-EIL1的二聚化活性有着重要的影响，因此推测EPR1功能域通过调控Sl-EIL-1的二聚化从而影响SL-EIL1的转录调控功能。
　　 (4)EIN3/EILs蛋白家族转录调控模式的建立。根据研究结论，我们对EIN3/EILs蛋白驱动下游基因的转录过程进行了分析和描述，并建立了EIN3/EILs蛋白转录调控模式图。
　　 此外，通过对Sl-EIL1转基因番茄的鉴定分析，我们对Sl-EIL1在番茄花发育及座果过程中的功能进行了研究，并初步认为Sl-EIL1对番茄花的发育及种子形成具有重要的作用。