莱氏野村菌微菌核的诱导培养及疏水蛋白基因Nrhyd的克隆与表达特征分析

摘要

昆虫病原真菌是自然界中害虫种群的重要控制因素，由于在害虫持续控制及维护物种多样性方面的特殊优势，其基础研究及应用均受广泛关注。莱氏野村菌是一种世界性广泛分布的昆虫病原真菌，可侵染多种鳞翅目的农作物害虫，此菌在适宜的环境下可引发害虫的流行病而使害虫批量死亡，所以具有很大的应用潜力。分生孢子是真菌生防制剂的有效成分，生防真菌主要通过分生孢子侵染害虫。但莱氏野村菌产分生孢子所需要的营养条件较苛刻，因此莱氏野村菌的规模化生产一直未有突破。本课题从以下两个方面开展研究工作：一是对产孢相关基因进行克隆与分析以探讨莱氏野村菌的产孢机理，二是寻找易于规模化生产的有效繁殖体(微菌核)来代替分生孢子。主要研究结果如下：
　　 ①首先对新分离到的菌株进行分类鉴定，将菌株鉴定为莱氏野村菌，编号为SDNr02。
　　 ②运用SMART RACE RT-PCR技术扩增莱氏野村菌的产孢相关基因疏水蛋白基因Nrhyd的cDNA全长序列，利用DNAMAN，Expasy等软件分析所推导氨基酸序列的基本性质和蛋白质结构，并利用Clustalx和MEGA软件构建Nrhyd因的系统发育进化树。结果表明莱氏野村菌Nrhyd基因的cDNA全长序列为733bp，包括339bp的开放阅读框，132bp的上游5’非翻译区(5’-UTR)和262bp的下游3’-非翻译区(3’-UTR)。在终止密码子下游3’-UTR有29bp的PolyA尾结构。蛋白质功能位点和信号肽预测分析表明，扩增得到的cDNA序列具有完整的5’端。莱氏野村菌疏水蛋白基因Nrhyd的前体蛋白理论分子量10.6kDa，理论等电点为6.19，共由111个氨基酸组成。其中包括典型的疏水蛋白功能结构域HYDRO(43-106氨基酸残基)，信号肽预测结果表明，Nrhyd基因编码的蛋白质具有18个氨基酸残基的信号肽序列，选取不同物种的疏水蛋白基因序列构建的系统发育进化树，结果显示莱氏野村菌的疏水蛋白基因Nrhyd与蝗绿僵菌CQMa102的hyd的亲缘关系最近，其次是金龟子绿僵菌。
　　 ③采用实时荧光定量PCR分析Nrhyd因在莱氏野村菌不同生长状态下的表达情况，结果显示Nrhyd基因菌株生长发育的不同时期的表达量差异显著。在不产孢的液体摇瓶培养条件下，Nrhyd基因表达量很低呈逐渐降低的趋势。在固体培养条件下Nrhyd基因的表达量随分生孢子的产生量的变化而变化，产孢量达到最大时，Nrhyd基因表达量最高，随后伴随着产孢量的下降，基因的表达量也开始降低，并且呈一直降低的趋势。
　　 ④通过改变培养液中碳浓度及碳氮比(C/N)来进行莱氏野村菌微菌核的诱导培养，结果显示2株供试莱氏野村菌CQNr01，SDNr02都可产生除菌丝体外的，缠绕紧密，色素沉着的微菌核结构。
　　 ⑤莱氏野村菌产生微菌核的数量受培养基成分的影响，低碳浓度的培养液比高碳浓度的培养液产生微菌核的数量大，CQNr01和SDNr02在低碳培养液中(C浓度4g/L，C/N：20/1)产生的微菌核浓度分别为1.3×104个/mL，1.2×104个/mL。在高碳培养液中(C浓度32g/L，C/N：20/1)产生的微菌核浓度分别只有0.8×102个/mL，0.78×102个/mL。在等碳浓度下，C/N较高的培养液比C/N低的培养出的微菌核数量大。而在相同C/N条件下，高碳浓度的培养液(C浓度32g/L，C/N为20:1)产生的生物量(CQNr01和SDNr02分别是37mg/mL，38mg/mL)却比低碳浓度培养液(C浓度4g/L，C/N为20:1)产生的生物量大(CQNr01和SDNr02分别是30mg/mL，29mg/mL)。
　　 ⑥对掺加硅藻土制备的微菌核制剂进行干燥处理及储存后进行活性测定，结果表明干燥处理并不影响的微菌核的活性，将干燥处理的微菌核再水化后接种到WA培养基平板上，2d后即可萌发长出菌丝，8d后便可产生大量的分生孢子。采用喷雾法进行微菌核制剂的毒力测定，所获的结果表明微菌核对斜纹夜蛾幼虫具有很高的致死率，接种14d后，供试昆虫的校正死亡率可达80％以上。
　　 结论：Nrhyd因为莱氏野村菌的疏水蛋白基因，该基因可能与分生孢子的形成相关，其表达水平受外界环境条件的影响，与分生孢子的动态产生量一致。本研究首次成功地诱导出了莱氏野村菌的微菌核结构，其形成数量具有受培养液中的营养成分显著影响，可通过改培养条件诱导莱氏野村菌微菌核结构的形成，干燥处理不影响微菌核的活性，经干燥处理后的微菌核复水处理仍能萌发产孢。利用该结构研发的应用制剂对斜纹夜的防治有较好的效果。