辣椒高效离体再生体系建立与CaCOI1基因的功能研究

摘要

辣椒为茄科中的一种重要物种，在世界范围广泛栽培。然而生物和非生物胁迫以及辣椒自身基因的易损性大大限制了辣椒生物技术的发展。通过基因工程生物技术对辣椒进行定向改造是辣椒育种的有效方法。离体再生技术与遗传转化技术促进了传统农作物育种技术的发展，同时还能改良辣椒性状。但由于辣椒较其它茄科植物再生困难，导致在利用DNA重组技术改良辣椒对生物和非生物胁迫抗性时增加了难度。
　　 本研究以辣椒常规品种新苏椒王为实验材料，利用均匀设计法比较系统地研究了辣椒离体再生的因素，如外植体类型、苗龄、外源生长物质种类浓度以及搭配等，建立了辣椒子叶高效离体再生体系，为辣椒遗传转化奠定基础。结果表明辣椒种Capsicumannuumvar.annuum(cv.Xinsu)的最佳外植体为幼苗子叶，而最佳苗龄为12天；最佳不定芽分化培养基为MS+IAA5.71μM+BA22.20μM+AgNO329.43μM，诱导率达99.20％；最佳延长培养基为MS+IAA5.71μM+BA4.44μM+AgNO329.43μM+GA35.77μM，延长率达86.67％；最佳生根培养基为MS+0.57μMIAA+0.69μMNAA，生根率达98.33％。通过试验证明成功建立了辣椒植株再生体系。
　　 COI1，基因是至今为止JA信号传导途径中分离克隆鉴定的唯一信号基因，也是目前研究所发现的拟南芥JA信号传导链中最重要的调控基因。COI1编码一个F-box蛋白，是SCFCOI1复合物的一个亚基，COI1与植物的育性和抗性两类完全不同的性状有关。COIl蛋白同生长素信号链中的TIR1蛋白类似，可调控辣椒的正常生理发育。我们从辣椒EST数据库中分离克隆了与番茄COI1，高度重复的部分片段，命名为CaCOI1。并对其作生物信息学分析其功能。并利用荧光定量PCR对CaCOI1基因做了表达模式分析，利用双元表达载体PBIN19构建了CaCOI1的沉默载体，通过农杆菌介导法转化辣椒。经验证后发现转基因辣椒都出现PCR目的条带，并发现转基因辣椒沉默株系部分雄性不育，果实偏小，抗性较弱，种子萌发率低。