低强度超声对iPSCs源性神经嵴干细胞增殖和分化的影响

摘要

周围神经损伤较为常见，各种外伤(如压迫、牵伸、撕裂、切断)以及其他因素(如局部缺血、肿瘤)都会造成神经系统部分或全部损伤，从而导致功能丧失和其他神经性疾病。尽管周围神经损伤的治疗效果随着科技的发展有了明显提高，但离真正的形态和功能重建还相差甚远。神经再生速度及功能恢复缓慢，并造成支配靶器官萎缩、变性及功能障碍是临床治疗的难点。结合周围神经组织工程原理，本文以诱导性多潜能干细胞源性神经嵴干细胞(induced pluripotent stem cells derived neural crest stem cells, iPSCs-NCSCs)为种子细胞来源，利用低强度超声刺激(low intensity ultrasound stimulation, LIUS)提高周围神经再生速度及功能恢复，重点考察了 LIUS作用对 iPSCs-NCSCs活性与增殖以及向神经元与施旺细胞(Schwann cells, SCs)分化的作用。主要研究工作和实验结果如下：
　　① iPSCs-NCSCs的多向分化潜能鉴定及细胞水平LIUS刺激的实现
　　分别通过成骨分化培养基、软骨分化培养基、成脂肪分化培养基、神经元分化培养基以及 SCs分化培养基考察 iPSCs-NCSCs的多向分化潜能，结果表明：iPSCs-NCSCs可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元以及SCs分化。
　　本实验使用意大利Cosmogamma公司制作的LIUS装置US10，实现固定频率(1 MHz)、占空比(Duty cycle)(20％)、脉冲重复频率(Pulse repetition frequency, PRF)(100 Hz)的不同强度超声刺激，实验中每次刺激时间为10分钟，改变超声强度研究LIUS对iPSCs-NCSCs活性、增殖和分化的影响。
　　② LIUS对iPSCs-NCSCs活性与增殖的影响
　　通过MTS法分析LIUS作用后iPSCs-NCSCs活性的变化，EdU试剂盒检测细胞增殖情况。MTS结果表明：与对照组相比，强度为300 mW/cm2和500 mW/cm2的LIUS辐照两天能促进iPSCs-NCSCs活性上调1.12(P<0.05)和1.19(P<0.01)倍；当强度提高到1500 mW/cm2时，细胞活性显著下降(P<0.05)。刺激四天后，LIUS对细胞的活性无显著影响(P>0.05)。
　　EdU染色结果表明：与对照组相比，强度为500 mW/cm2的LIUS辐照两天促使EdU+细胞数目由20.1±1.8增加为30.7±7.4(P<0.05)，细胞增殖率由19.24±2.11%上升到23.59±1.17%(P<0.05)；当强度升高到1500 mW/cm2时，EdU+细胞数目减少到12.1±5.1(P<0.05)，对细胞增殖率无显著影响。强度为500 mW/cm2的LIUS辐照四天可以促使 EdU+细胞数目由4.2±1.5增加为13.9±5.6(P<0.05)，细胞增殖率由3.12±0.90%上升为7.87±2.23%(P<0.01)，强度为1500 mW/cm2的LIUS对细胞增殖无显著影响。
　　③ LIUS对iPSCs-NCSCs向神经元和SCs分化的影响
　　分别采用实时定量PCR和免疫荧光分析LIUS对iPSCs-NCSCs中神经元和SCs标志物mRNA和蛋白表达的影响。实时定量PCR结果表明：与对照组相比，强度为300 mW/cm2和500 mW/cm2的LIUS辐照四天可分别促进iPSCs-NCSCs中NFM的mRNA表达上升1.22和1.41倍，促进iPSCs-NCSCs中S100β的mRNA表达上升2.05和1.79倍；强度为500 mW/cm2的LIUS可以分别促进iPSCs-NCSCs中Tuj1和GFAP的mRNA表达上升1.36倍和2.1倍。强度为500 mW/cm2的LIUS辐照七天可显著提高NFM、GFAP和S100β的mRNA表达水平，但对Tuj1的mRNA表达无明显影响。
　　免疫荧光染色结果表明：强度为500 mW/cm2的LIUS分别辐照四天和七天后均可促进iPSCs-NCSCs中NFM、Tuj1、GFAP和S100β荧光强度的增强，说明LIUS在500 mW/cm2可以促进神经元及SCs标志物蛋白的表达。
　　本文的研究结果表明强度为500 mW/cm2的LIUS一方面可以提升iPSCs-NCSCs活性并促进其增殖，另一方面还可以促进iPSCs-NCSCs向神经元及SCs分化。本文的研究结果对于探索高效周围神经损伤修复方法具有重要的理论和临床意义。

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英汉缩略词表

1 绪论

1.1 问题的提出及研究意义

1.2 本文研究的目的和研究内容

2 iPSCs-NCSCs的培养和鉴定以及LIUS刺激的实现

2.1 引言

2.2 材料与试剂

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 LIUS辐照细胞的实现

2.6 讨论与分析

2.7 本章小结

3 LIUS对iPSCs-NCSCs活性和增殖的影响

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 分析讨论

3.6 本章小结

4 LIUS对iPSCs-NCSCs向神经元和SCs分化的影响

4.1 引言

4.2 实验试剂与仪器

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 分析讨论

4.6 本章小结

5 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 后续工作展望

致谢

参考文献

附录

A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录：

B. 作者在攻读学位期间参与的科研项目目录：