人白三烯C4合成酶荧光定量PCR检测方法的建立及糖皮质激素对哮喘儿童体内白三烯代谢的影响

摘要

目的：在RT-PCR基础上进一步发展的实时荧光定量PCR技术(FQPCR)是目前定量最准确的基因定量技术，目前国内外尚未建立半胱氨酰白三烯(CysLTs)合成主要限速酶白三烯C4合成酶(LTC4S)表达水平的FQPCR检测方法，本研究拟建立LTC4SmRNA表达水平的FQPCR检测方法，为临床与基础研究提供能准确反映体内LTC4S基因表达水平的检测手段，便于进一步了解白三烯(LTs)在哮喘发病机制中的地位。糖皮质激素(GCs)是目前最有效的抗气道炎症药物，吸入糖皮质激素(ICS)是哮喘规范治疗的首选用药，但临床发现哮喘儿童对ICS的治疗反应具有个体差异，部分患儿尽管长期规律使用ICS病情仍迁延反复，推测该部分患儿可能体内存在不能被GCs有效抑制的某种(些)炎症介质。CysLTs是参与哮喘气道炎症与重塑的重要介质，且目前有关GCs能否有效抑制体内CysLTs合成与释放尚无一致结论，因此有理由推测，CysLTs表达和合成水平的个体差异可能是决定哮喘儿童ICS疗效的因素之一，目前缺乏相关的研究。本研究拟比较ICS控制良好与控制不佳两组哮喘儿童体内CysLTs表达与分泌水平，了解体内CysLTs水平的高低是否是决定哮喘儿童ICS疗效个体差异的主要因素之一。另外，本研究同时观察口服GCs及吸入ICS对哮喘儿童CysLTs基因表达和分泌水平的影响，进一步明确GCs能否有效抑制哮喘儿童体内CysLTs的合成，可望为哮喘药物的发展及最佳联合用药方案的选择提供依据。方法：1.本研究通过基因克隆方法，构建含人LTC4ScIDNA的质粒标准品从而建立LTC4SmRNA的RT-FQPCR检测方法，用于检测外周血多型核白细胞LTC4S的表达；应用竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)检测尿LTE4水平。2.选取5～12岁已规律使用ICS3个月以上非急性发作期哮喘儿童32例，按病情分为ICS控制良好与ICS控制不良组，5～12岁健康儿童10例作为对照组，观察外周血多型核白细胞(PMNL)LTC4SmRNA表达与尿LTE4分泌水平。3.选取非急性发作期5～12岁哮喘儿童10例，予口服强的松1mg/Kg(最大剂量为20mg/d)，每日晨间顿服，治疗期为1周。观察治疗前后外周血PMNLLTC4SmRNA表达与尿LTE4分泌水平。4.选取5～12岁既往无使用过ICS的非急性发作期哮喘儿童共10例，采用都保干粉吸入装置吸入布地奈德(BUD)800μg/d，疗程4周，观察治疗前后外周血PMNLLTC4SmRNA表达与尿LTE4分泌水平。 结果：1.哮喘儿童组外周血PMNLLTC4SmRNA表达水平明显高于健康对照组儿童，其中ICS控制不良组表达水平最高，与ICS控制良好组和健康对照组比较均有统计学意义差异(P均＜0.05)，但ICS控制良好组和健康对照组之间比较无统计学意义差异(p＞0.05)。哮喘儿童组与健康对照组尿LTE4分泌水平无统计学意义差异(p＞0.05)，ICS控制良好组、ICS控制不良组及健康对照组之间比较尿LTE4分泌水平也无统计学意义差异(p均＞0.05)。ICS使用≥12月的哮喘儿童外周血PMNLLTC4SmRNA表达水平明显低于使用ICS＜12月的患儿，但仍显著高于健康对照组，提示长程规范ICS治疗可一定程度降低哮喘儿童CysLTs合成主要限速酶的表达。2.哮喘儿童口服强的松1周后外周血PMNLLTC4SmRNA及尿LTE4分泌水平与口服前比较均无统计学意义差异，提示短程全身用激素不能有效抑制哮喘儿童体内CysLTs合成。3.既往无使用过ICS的哮喘儿童吸入BUD800ug/d治疗1月后外周血PMNLLTC4SmRNA及尿LTE4分泌水平均有下降趋势，但未达差异统计学意义，提示较短程使用ICS不能有效抑制哮喘儿童体内CysLTs合成，但延长规律使用ICS的时间有可能有效控制哮喘患儿体内CysLTs合成。 结论：1.FQPCR法检测LTC4SmRNA表达水平能较尿LTE4更敏感反映哮喘儿童CysLTs表达水平，该方法的建立可为临床与基础研究提供能更准确反映体内LTC4S基因表达水平的检测手段，便于进一步了解LTs在哮喘发病机制中的地位，并为哮喘药物的发展和疗效的评估提供客观依据。2.哮喘儿童LTC4SmRNA表达水平增高，且规范使用ICS控制不良组显著高于ICS控制良好组儿童，提示CysLTs表达和合成水平明显增高可能是个体长程规范使用ICS控制不良的原因之一。3.短程全身用激素或较短程(＜1年)吸入糖皮质激素均不能有效抑制哮喘患者体内CysLTs合成，哮喘儿童长程规范使用ICS(＞1年)其CysLTs表达水平下调但仍高于健康对照组，为选择吸入ICS与口服白三烯调节剂联合治疗方案治疗儿童哮喘提供理论依据，并进一步强调哮喘儿童必须坚持长程规范治疗的重要性。

目录

中英文对照词汇表

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

·综述·白三烯研究进展及其在婴幼儿喘息性疾病中的作用

致谢