抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

摘要

目的： 制备能稳定分泌高效价、高特异性抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)转肽酶区蛋白的单克隆抗体(mAb)，进而建立敏感、特异的检测PBP2a的乳胶凝集法，为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定基础。 方法： 1、优化免疫方案，以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白为抗原，与福氏佐剂混合形成油包水的乳状颗粒，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠NS-1骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA法筛选阳性克隆孔，有限稀释法进行阳性孔克隆化。经过反复筛选及4次克隆化后，获得能稳定分泌抗PBP2a转肽酶区蛋白mAb的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞注入经降植烷预处理的BALB/c小鼠腹腔制备腹水型mAb，采用简便、快速的辛酸-硫酸铵法对腹水进行纯化。对所制备的mAb进行了鉴定，包括染色体分析、免疫球蛋白亚型及亚类鉴定、亲和常数测定、特异性鉴定、中和抑制作用分析及稳定性鉴定。 2、用碱裂解法提取MRSA细胞壁上的膜蛋白，与抗PBP2a转肽酶区蛋白mAb致敏(物理吸附法)的乳胶进行反应，建立了检测PBP2a的乳胶凝集法。应用初步建立的乳胶凝集法，对临床分离的20株金黄色葡萄球菌进行检测，并将其结果与Biomerieux. 结果： 1、以50gg抗原间隔21天足垫加皮下免疫所获得抗血清效价最高，取脾融合后获得2株能稳定分泌抗PBP2a转肽酶区蛋白mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为F1和F2，两株杂交瘤细胞染色体数目为两亲本细胞染色体数目之和； 2株均为IgG1类；腹水效价分别为0.5×10<'6>和1×10<'6>，亲和力常数分别为1.57×10<'8>M<'-1>和5.43×10<'8>M<'-1>；Western blot显示F1、F2抗体均能有效识别重组PBP2a转肽酶区蛋白及MRSA临床分离株中的天然PBP2a； 中和抑制试验表明杂交瘤细胞培养上清、腹水中的抗体能明显被重组PBP2a转肽酶区蛋白所中和；用辛酸一硫酸铵法纯化的IgG1型mAb达到电泳纯，纯化前后mAb效价无改变； 2株杂交瘤细胞株在液氮冻存半年后仍能稳定分泌特异性的mAb。 2、建立的乳胶凝集检测法特异性、敏感性和稳定性良好，初步临床验证显示其能够准确检测耐甲氧西林葡萄球菌，对耐甲氧西林葡萄球菌感染的快速鉴定具有良好的应用价值。 结论： 1、50μg抗原间隔21天足垫加皮下免疫为本试验中最佳免疫方案。 2、成功制备了2株特异性好、亲和力强，能稳定分泌抗PBP2a转肽酶区蛋白mAb的杂交瘤细胞株。 3、建立了检测PBP2a的乳胶凝集法, 初步临床验证显示其能够快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

目录

中、英文缩写对照

前 言

第一部分：抗PBP2a转肽酶区蛋白mAb杂交瘤细胞株的制备与鉴定

材料与方法

实验结果

讨 论

第二部分PBP2a胶乳凝集检测法的建立

材料和方法

实验结果

讨 论

结 论

参考文献

附 图

综述 单克隆抗体制备技术研究进展

致 谢

在校期间发表的论文