线粒体转录因子A基因多态性在高原肺水肿发生中的作用及机制的初步研究

摘要

目的：平原人进入高原后，机体会发生一系列的代偿适应性变化，以适应高原环境，这个过程称为习服，若习服不良则可能发生高原病，例如高原肺水肿(high altitude pulmonary edema, HAPE)。线粒体是机体能量代谢的中心，在低氧细胞损伤和组织、细胞对低氧环境的习服过程中有非常重要的作用。我室以往的研究结果提示，线粒体功能改变是细胞低氧习服-适应的关键环节。反之，线粒体结构损伤和功能障碍，则可能是引起机体对于高原低氧环境习服不良，甚至发生高原病(如HAPE)的重要因素。HAPE的发生机制尚不清楚，目前认为与肺血管收缩，肺动脉压过度升高、肺毛细血管通透性增加、肺泡II型上皮细胞水清除障碍等因素有关。近来研究表明，缺氧时线粒体功能障碍，活性氧(reactive oxygen species, ROS)过度生成，在缺氧引起的肺血管平滑肌细胞收缩、肺水清除障碍的发生中起重要作用，缺氧线粒体功能障碍可通过多种途径参与HAPE的发生。综上所述，我们推测，HAPE的发生可能与线粒体DNA（mitochondrial DNA， mtDNA）稳定性降低，线粒体功能障碍有关，而线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A,TFAM）作为mtDNA稳定性的重要调控因子，其基因多态性与HAPE发生易感性之间的关系有待深入研究。
　　方法：在西藏日喀则地区(海拔3836 m)收集汉族HAPE患者和高原健康对照外周血标本各60例。HAPE患者纳入标准根据1995年中华医学会公布的高原肺水肿诊断标准，高原健康对照选取同期进入日喀则地区的健康汉族人。所有受试者均排除已知的肺脏疾病、心血管疾病以及线粒体相关疾病等。采用全血基因组 DNA提取试剂盒提取基因组DNA，采用超螺旋敏感的qPCR方法检测HAPE患者mtDNA稳定性；采用普通PCR扩增试剂盒，扩增TFAM基因7个外显子及其相邻非编码区序列并测序，经与NCBI基因组数据库网站获取的人类TFAM基因序列(TFAM transcription factor A, mitochondrial[Homo samiens(human)], Gene ID:7019, updated on27-Mar-2014)比对，获得单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism, SNP)并进行基因分型，采用卡方检验分析比较SNPs位点在HAPE患者和高原健康对照之间的等位基因和基因型频率分布，采用Binary logistic分析比较各基因型的发病风险，采用Match软件(http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html＃match)，在线分析TFAM基因全序列转录因子结合位点；采用单因素方差分析或双因素方差分析，比较TFAM SNPs位点基因型对mtDNA损伤的影响，并评价其在HAPE发生中的作用。
　　结果：⑴HAPE患者原始模板细胞色素b(cytochrome b, cytb)基因拷贝数(1.590±0.092)显著高于高原健康对照(1.245±0.076)(p=0.005)，HAPE患者加热模板cyt b基因拷贝数(0.865±0.045)显著低于高原健康对照(1.079±0.057)(p=0.004)；HAPE患者加热模板 COXIII基因拷贝数(1.159±0.061)与高原健康对照(1.044±0.039)比较无显著差异(p=0.115)，但其原始模板细胞色素 c氧化酶亚基(cytochrome c oxidase subunit, coxⅢ)基因拷贝数(1.354±0.069)显著高于高原健康对照(1.170±0.069)(p=0.049)。HAPE患者(1.291±0.154)与高原健康对照(1.167±0.094)4977bp片段缺失发生率无显著性差异(P=0.494)。⑵在高原健康对照和HAPE患者TFAM的7个外显子序列和部分相邻非编码区序列发现了4个SNP位点：A281T、C305T、rs1937、A3790G。其中rs1937多态性位点已有文献报导，而A281T、C305T、A3790G多态性位点为本研究首次发现。经转录因子结合位点分析发现，A281T位点位于转录因子Staf结合序列内，可能参与TFAM转录调节。⑶HAPE患者TFAM A281T多态性位点T等位基因(0％)和AT基因型频率(0%)显著低于高原健康对照(15%，30%)(p=0.000，p=0.000)，以A等位基因为参照，T等位基因对于HAPE发病具有保护作用(OR=0.850，CI：0.788-0.916)，以AA基因型为参照，AT基因型是HAPE发生的保护性因素(OR=0.800，CI：0.705-0.908)。C305T、rs1937、A3790G位点的基因多态性与HAPE发生的易感性无显著性相关(p>0.05)。⑷通过扩增mtDNA编码基因cytb反映mtDNA拷贝数，结果发现高原健康对照(1.355±0.102)和HAPE患者(1.590±0.092)281AA基因型的原始模板mtDNA拷贝数显著高于281AT基因型(0.990±0.061)(p=0.048，p=0.001)，且高原健康对照281AA基因型(1.061±0.065)和281AT基因型(1.118±0.117)加热模板mtDNA拷贝数均显著高于 HAPE患者281AA基因型(p=0.015，p=0.019)。通过扩增 mtDNA编码基因COX III反映mtDNA拷贝数，结果发现高原健康对照(1.281±0.079)和HAPE患者(1.354±0.069)281AA基因型的mtDNA原始模板mtDNA拷贝数显著高于高原健康对照281AT基因型(0.912±0.058)(p=0.009，p=0.001)，各组间加热模板 mtDNA拷贝数相差不显著(F=1.363，p=0.260)。C305T、rs1937、A3790G位点的基因多态性对mtDNA稳定性无显著性影响(p>0.05)。
　　结论：①mtDNA稳定性降低是HAPE发生的一个重要因素；②报导了TFAM A281T、C305T、A3790G SNPs位点；③TFAM A281T多态性位点的T等位基因和AT基因型是HAPE的保护性因素，对于HAPE的发生具有重要的预测价值，其在HAPE发生机制中的作用值得进一步深入研究；④TFAM281AT基因型可能影响转录因子Staf与反式作用元件结合，有利于增强mtDNA稳定性，从而降低HAPE发生的易感性。

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中文摘要

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一．前 言

1. 研究背景

2. 国内外研究现状

3. 研究设想

4、论文拟解决的问题

5、理论意义与实用价值

二、 mtDNA稳定性改变在HAPE发生中的作用

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

三．TFAM单核苷酸多态性与HAPE易感性的关联分析

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

四．TFAM SNPs位点基因型对mtDNA损伤的影响及其在HAPE发生中的作用

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

五.结论

参考文献

致谢

七.附录

附录A：缩略语对照表

附录B：所发表论文

附录C：个人简历

附录D 文献综述: 线粒体DNA稳定性与相关疾病研究进展