C-反应蛋白诱导晚期糖基化终产物受体表达的信号途径及其干预研究

摘要

[背景]糖尿病是一种高花费、高致残、高死亡的疾病。其并发症已成为主要和日益严重的健康问题。心血管疾病是糖尿病患者致残、致死，并造成经济损失的主要原因。因心血管疾病而死亡的糖尿病患者中，冠心病约占一半。糖尿病动脉内皮细胞功能障碍、动脉内皮损伤，继之对血管损伤的反应提早发生和加速性动脉粥样硬化是增加冠心病事件及导致死亡的重要原因。晚期糖基化终产物受体（RAGE）在内皮功能紊乱中发挥重要作用，诱导多种黏附分子、炎症因子如细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、E-选择素、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、内皮素-1（ET-1）表达升高。RAGE与配体结合后促使炎症细胞聚集、血管平滑肌细胞（VSMC）增殖、活性氧自由基（ROS）生成增多，在加速性动脉粥样硬化发生、发展中起重要作用。在糖尿病相关模型的动脉粥样斑块中，晚期糖基化终产物（AGEs）的沉积增高及RAGE表达升高。给予可溶性晚期糖基化终产物受体（sRAGE）后，斑块面积和复杂性下降，斑块变稳定。 前期研究发现炎症反应标记物C反应蛋白（CRP）诱导内皮细胞在mRNA及蛋白水平表达RAGE并促进MCP-1的过度生成，在加速性动脉粥样硬化的发生发展中起关键作用。在生理状态下，核转录因子κB（NF-κB）与其抑制蛋白IκB结合以无活性的三聚体形式存在于胞浆中。当细胞受到刺激IκB被降解然后解除对NF-κB的抑制作用，NF-κB迅速活化进入胞核孔体内发挥基因转录的调控作用。人RAGE基因启动子含2个NF-κB元件，RAGE下游信号包括NF-κB，提示RAGE本身存在一个自我调控的正反馈回路，当RAGE与其配体结合后激活NF-κB促发后效应同时，RAGE表达可以自我上调。CRP可以通过降解IrB-α使NF-κB活化，故本实验推测CRP通过激活NF-κB诱导RAGE的生成，并予以证明。 过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）是核受体超家族成员之一，通过结合配体活化转录因子进而调控基因表达。PPARα激动剂是临床常用治疗脂质紊乱药物，具有抗动脉粥样硬化作用。PPARα激动剂可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成，通过降低E-选择素，VCAM-1的表达、抑制ET-1表达、减少ROS的表达、增加内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达量从而发挥其抗动脉粥样作用。WY14643也称为匹立尼酸，属于PPARα配体。研究报道WY14643可以抑制CRP诱导的内皮细胞MCP-1的过度表达。根据PPAα激动剂WY14643的抗炎抗动脉粥样硬化作用，我们推测WY14643可能可以抑制CRP诱导内皮细胞生成RAGE和MCP-1。因此目前研究主要目的为探讨CRP-RAGE-MCP-1轴的作用机制及WY14643的干预作用。 [方法] 1.人脐静脉内皮细胞的体外原代培养及传代培养； 2.利用流式细胞技术检测WY14643对内皮细胞表达RAGE蛋白的影响； 3.利用RT-PCR检测WY14643对内皮细胞表达RAGE mRNA的影响； 4.利用ELISA法检测CRP上调内皮细胞RAGE的表达是否通过NF-κB途径及WY14643对其影响； 5.利用流式细胞技术检测CRP上调内皮细胞RAGE蛋白表达是非通过NF-κB途径及WY14643对其影响； 6.利用RT-PCR检测CRP上调内皮细胞RAGE mRNA表达是非通过NF-κB途径及WY14643对其影响； 7.利用ELISA方法检测CRP上调内皮细胞表达MCP-1是非通过NF-κB途径及WY14643对其影响。 [结果] 1.WY14643对内皮细胞表达RAGE蛋白的影响（流式细胞技术） 1）不同浓度WY14643作用内皮细胞24小时对RAGE蛋白表达的影响 与对照组相比，加入WY1464310μM即可见RAGE蛋白表达量下降，在WY14643100μM时RAGE蛋白表达抑制更为明显，WY14643浓度为250μM时RAGE蛋白表达量最低。 2）250μM WY14643作用内皮细胞不同时间对RAGE蛋白表达的影响WY14643组RAGE蛋白的量均低于对照组。RAGE蛋白表达量在培养6小时即有下降，并在24小时达到最小值。 2.WY14643对内皮细胞表达RAGE mRNA的影响（RT-PCR法） 1）不同浓度WY14643作用内皮细胞24小时对RAGE mRNA表达的影响加入WY1464310μM即可见RAGE mRNA表达量有所下降，WY14643100μM对RAGE mRNA表达抑制更加明显，WY14643浓度为250μM时抑制RAGE mRNA表达最明显。 2）250μM WY14643作用内皮细胞不同时间对RAGE mRNA表达的影响 将250μM WY14643加入内皮细胞培养不同时间（6、12、24小时），发现WY14643组中目标基因PCR产量均低于对照组。RAGE mRNA表达量在培养6小时即有下降，并在24小时达到最低值。 3.CRP通过激活NF-κB诱导内皮细胞表达RAGE，并可被WY14643抑制（流式细胞技术，RT-PCR法，ELISA法） 1）流式细胞技术检测RAGE蛋白表达 与对照组相比，CRP组RAGE蛋白表达升高。提前1小时加入NF-κB拮抗剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）阻断NF-κB途径再加CRP作用内皮细胞发现RAGE蛋白表达较CRP组下降。CRP和WY14643共作用组RAGE蛋白表达较CRP组下降。 2）RT-PCR检测RAGEmRNA表达 与对照组相比，CRP组RAGE mRNA表达升高。CRP与PDTC共作用组RAGE mRNA表达较CRP组明显下降。CRP与WY14643共作用组RAGEmRNA表达较CRP组明显下降。 3）ELISA检测磷酸化NF-κB p65水平 与对照组比较，CRP组磷酸化NF-κB p65水平升高。CRP与PDTC共作用组及CRP与WY14643共作用组磷酸化NF-κB p65水平较CRP组明显下降。 4.CRP通过激活NF-κB诱导内皮细胞表达MCP-1，并可被WY14643抑制（EUSA法） ELISA检测MCP-1表达：与对照组比较，CRP组MCP-1水平明显升高。CRP与PDTC共作用组或与WY14643共作用组MCP-1水平较CRP组明显下降。 [结论]本实验结果提示CRP通过激活NF-κB途径诱导内皮细胞RAGE和MCP-1的表达。WY14643可以从蛋白和mRNA水平抑制内皮细胞RAGE的表达，在一定程度内呈浓度-时间效应；并抑制CRP诱导内皮细胞RAGE和MCP-1的表达，从而阻断CRP-RAGE-MCP-1轴。为治疗加速动脉粥样硬化提供可能的途径。

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综述 晚期糖基化终产物受体在心血管疾病中的研究进展

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