FMR1基因敲除小鼠耳蜗形态学研究及其耳蜗、听觉皮层中GAD、GABAα1受体表达与AGS的关系

摘要

研究背景：脆性X综合佂（FXS）是染色体异常所致的智力低下综合征，是遗传性精神发育迟缓的主要病因之一，患病率仅次于Down综合征。FXS是单基因遗传性疾病,它是由X连锁的FMR1基因5’端(CGG)n三核苷酸重复序列异常扩增及其相邻部位的CpG岛异常甲基化,使其编码产物FMRP(fragile X mental retardation protein)不能正常表达所致。临床症状表现包括：智力障碍、语言障碍、行为异常和癫痫等，部分病人有巨睾和特殊面容。癫痫发作是FXS神经系统常见表现，据报道20%～25%的脆性X综合征患者发生癫痫[1，2]，而阵发的脑电图异常则高达50%[3]。目前已证实FMRP是一种mRNA结合蛋白，主要起mRNA翻译抑制作用，从而对蛋白起到负性调控的作用，但FMRP缺失导致各种临床表型的分子机制尚不明确。FMR1基因敲除（FMR1KO）鼠几乎表现了脆性X综合征病人的所有表型。听源性惊厥是主要特点之一[4，5]，但听源性惊厥发作的原因及机制尚不明确。我科马钊恩在前期FMR-1KO小鼠的ABR研究中发现幼年期KO鼠听阈提高，成熟期FMR-1KO小鼠听阈无异常，KO小鼠AGS发生的年龄依赖性与ABR的结果相一致。我院神经内科研究所前期研究中亦发现FMR1KO鼠较WT鼠更具热性惊厥易感性，主要表现为热诱导惊厥持续时间长。有报道在杏仁核点燃的癫痫模型上，FMR1KO鼠较野生（WT）鼠癫痫更易被点燃，苔藓样纤维明显增加[6]；因此FMR1KO鼠被认为是一个有效的AGS发作的模型。遗传性智能低下疾病常伴有癫痫，应用FMR1KO鼠这一单基因疾病模型研究遗传因素导致的癫痫生物学特征以及发生机制，可能为该类疾病发病机制的研究提供一个新的思路。正常的神经生理活动是神经环路上兴奋和抑制的平衡。神经元环路中，中间神经元（即GABA能神经元，γ-aminobutyric acid，GABA）是主要的抑制性神经元,目前一般认为谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）是GABA能神经元的直接标记物，GAD只在GABA能神经元中表达。近年来对癫痫多个领域的研究证实GAD与癫痫密切相关。癫痫的发生是脑内兴奋-抑制失衡的结果，GABA作为中枢神经系统最具代表性的抑制性神经递质，其细胞外浓度的变化在神经元兴奋性的改变、异常放电的过程中起着举足轻重的作用。Marini等也发现GABAA受体基因突变可能是儿童失神性癫痫(CAE)、热性惊厥的原因之一[7]。在动物研究中发现获得性癫痫模型鼠，癫痫后6小时至7天,海马内GABA能神经元持续减少,尤其以癫痫后48小时至7天改变最为明显； 癫痫后6小时，大鼠海马GABAA受体α5（γ-aminobutyric acid A receptor α5，GABAARα5）亚单位的表达开始下降，72小时至7天后，GABAARα5亚单位的表达显著降低[8]。以上这些实验结果都提示GABAA受体的改变可能是癫痫的主要原因。有研究发现FMR1KO鼠大脑皮层PV阳性神经元（GABA能神经元的一个亚型）的数目明显低于WT鼠[9]；FMR1KO鼠皮层、海马、丘脑、脑干的GABA受体β、δ亚基表达明显减少[10，11]，FMR1KO鼠海马脑片电生理检测发现，灌注GABAA受体拮抗剂荷苞牡丹碱后，可以引发持久的癫痫样放电[12]。因此，我们推测KO鼠耳蜗形态学变化是否是KO鼠AGS原因，以及在GABA能神经元数目、结构或GABA受体结构或数量等方面的异常，可能在脆性X综合征惊厥易感性的形成机制中起着非常重要的作用，而关于这方面的研究，国内外未见详细报道。 目的：利用通过HE染色方法，观察不同周龄KO与WT小鼠耳蜗形态学变化；利用免疫组织化学方法，观察不同周龄KO与WT小鼠耳蜗及大脑听觉皮层GAD与GABAα1受体的表达，探讨GAD与GABAα1受体的表达是否受FMRP的影响，探讨FMR1KO鼠听源性惊厥的原因，为FMR-1基因敲除小鼠听源性惊厥的发病机理及治疗提供一定的依据。 方法：⑴实验动物：FMR1基因敲除型（KO）纯合子（-/-）及其野生型(WT)纯合子(+/+)FVB近交系小鼠。⑵实验动物基因型鉴定：采用PCR法及蛋白印迹两种方法检测实验小鼠的Fmr-1基因片段。⑶动物分组：实验动物80只。分两组（1）KO组（3周龄，4周龄，6周龄，8周龄，每周龄10只）共40只；（2）WT组（3周龄，4周龄，6周龄，8周龄，每周龄10只）40只。用于免疫组织化学染色及HE染色。⑷数据及图像的采集：免疫组化的结果用Image J 13.7软件对免疫组织化学GAD与GABAα1受体表达的阳性细胞数进行分析。⑸统计方法：用SPSS16.0软件进行统计学分析，P值﹤0.05为有统计学意义。各组数据均用均数±标准差(X±SD)表示，单组数据比较采用独立样本t检验，多组数据的比较用单因素的方差分析（one-way AVONA）。 结果：①经基因及蛋白印迹鉴定后KO组小鼠均为FMR-1基因敲除型小鼠。②耳蜗HE染色结果：3周、4周、6周、8周各年龄组WT鼠较KO鼠形态学观察无差异。③免疫组织化学染色：3周、4周、6周龄各组小鼠各基因型间KO小鼠的耳蜗、听觉皮层中GAD表达的平均阳性细胞数均高于WT小鼠，P<0.01，差异具有显著性；8周KO小鼠耳蜗、听觉皮层中GAD表达的平均阳性细胞数较WT小鼠比较，P〉0.05，差异无统计学意义。3周、4周、6周各组小鼠各基因型间KO小鼠耳蜗、听觉皮层中GABAα1受体表达的平均阳性细胞数均低于WT小鼠，P<0.01，差异具有显著性；8周KO小鼠耳蜗、听觉皮层中GABAα1受体表达的平均阳性细胞数较WT小鼠比较，P〉0.05，差异无统计学意义。④FMR1基因KO小鼠3、4、6、8不同周龄耳蜗及听觉皮层GAD阳性细胞数表达随周龄增加逐渐减少，P<0.01，差异具有显著性；不同周龄WT小鼠耳蜗及听觉皮层GAD阳性细胞数表达无差异性，P〉0.05，差异无统计学意义。不同周龄KO小鼠耳蜗GABAα1受体阳性细胞数表达无随年龄增加逐渐增加或减少趋势，P〉0.05，差异无统计学意义；不同周龄KO小鼠听觉皮层 GABAα1受体阳性细胞数表达随周龄逐渐增加，P<0.01，差异有统计学意义；不同周龄WT小鼠耳蜗及听觉皮层GABAα1受体阳性细胞数表达无年龄差异性，P〉0.05，差异无统计学意义。 结论：⑴本研究首次发现FMR-1基因敲除小鼠与WT小鼠耳蜗HE染色后观察形态结构无明显差异。⑵3、4、6周各组KO小鼠的耳蜗、听觉皮层中GAD表达的平均阳性细胞数均高于WT小鼠；8周KO小鼠耳蜗、听觉皮层中GAD表达的平均阳性细胞数较WT小鼠比较结果无差异。⑶3、4、6周各组KO小鼠耳蜗、听觉皮层中GABAα1受体表达的平均阳性细胞数均低于WT小鼠，8周KO小鼠耳蜗、听觉皮层中GABAα1受体表达的平均阳性细胞数较WT小鼠比较结果无差异。⑷FMR-1KO小鼠耳蜗、听觉皮层中GAD与GABAα1受体阳性细胞数表达具有年龄依赖性，可能是KO鼠AGS原因之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照

声明

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

小结和展望

References

综述 听觉系统中 GAD 与A 型γ-氨基丁酸受体的作用及研究进展

附图

致谢