PI3K/Akt抑制剂对鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性影响的实验研究

摘要

一、研究目的 本课题从体外实验研究PI3K／Akt抑制剂（LY294002）对鼻咽癌细胞CNE-1放射敏感性的影响并探讨其可能机制，为探讨鼻咽癌放射增敏靶点提供实验依据。 二、实验方法 1.体外培养人鼻咽癌细胞CNE-1,本实验分为四组:对照组(A)、单纯放射组(B)、单纯药物组©、加药联合放射组(D)，按细胞逐步稀释,采用的逐渐增加的放射剂量,分别为0 Gy、2 Gy、4 Cy、6 Gy、8 Gy、10 Gy，PI3K／Akt抑制剂（LY294002）的试验浓度为20μmol／L，利用细胞克隆形成实验观察各组CNE-1细胞存活情况,单击多靶数学模型以及L-Q模型拟合剂量存活曲线。 2.采用流式细胞仪技术分析四组细胞周期分布和细胞凋亡率，其中照射组予单独单次总剂量2Gy。 3.RT-PCR检测Bad、Ku70、Ku80mRNA的表达；western blot方法检测磷酸化Akt(pAkt)和凋亡相关蛋白Bad蛋白的表达。 4.数据分析以及统计结论:实验的数据结果均值用x+s表示，两组比较用t检验,组间比较采用单因素方差分析,相关性采用pearson直线相关分析，p<0．05认为有统计学显著差异。本试验统计工具采用SPSSl6.0统计软件行数据分析,以及SigmaPlot11.0辅助分析以及制图。 三、实验结果 1.LY294002联合照射组Do、Dq、SF2明显比单纯放射组低。CNE-1细胞集落形成实验结果显示:鼻咽癌细胞受不同剂量照射后,B组和D与A组相比，细胞集落形成能力受抑制，放射剂量的增加，集落形成能力受抑制更明显；在相同的放射剂量时，D组细胞集落形成率明显低于B组；根据数据结果在电脑拟合的细胞存活曲线,其结果显示:D组Do值为0．522 Gy，Dq值为2.54Gy；B组Do值为0.783 Gy，Dq值为2.16 Gy,SER为1.36；a/β值B组(1.78Gy)小于D组(9.65Gy)；LY294002联合照射可以提高放射敏感性。 2.流式细胞仪结果：PI3K／Akt抑制剂（LY294002）与CNE-1细胞作用后，出现明显的G2／M期阻滞,导致G2／M期细胞比例增加。四组的G2／M期细胞比例分别为：20.04%、29.12%、35.37%、48.13%，其中D组G2／M期比例最高,与各组相比有统计差异(p<0．05)。凋亡率检测结果表明各处理组凋亡指数均增高，B组C组和D组分别是A组的3．54、4.63、6．33倍(p<0．05)，D组凋亡指数最高；G2／M期细胞与凋亡指数相关分析结果显示二者间存在正相关关系（rs=0．863，p<0.05）。 3.RT-PCR结果显示放射以及抑制剂LY294002均可提高Bad mRNA的表达，而药物联合放射组中Bad mRNA的表达显著增高，(p<0．05)；放射后Ku70mRNA的表达增高，而抑制剂LY294002单纯作用CNE-1细胞后Ku70mRNA的表达水平无改变，但联合放疗后，可以降低放射后的Ku70mRNA的表达水平，(p<0．05)；本实验中Ku80 mRNA的表达水平在各实验组中未观察到明显改变。 4.Western blot结果：LY294002联合放射组Bad蛋白表达增高，与PCR结果一致；放射后pAkt的表达无明显变化，LY294002作用CNE-1细胞后pAkt蛋白表达减低，证实LY294002可抑制细胞内pAkt，抑制剂联合放射后，pAkt受抑制更加明显(p<0．05)。 四、结论 1.LY294002对体外鼻咽癌细胞CNE-1具有放射增敏作用； 2.LY294002对体外鼻咽癌细胞CNE-1放射增敏的作用主要通过降低pAKT水平,抑制P13K／Akt传导路径功能实现； 3.LY294002对体外鼻咽癌细胞CNE-1放射增敏的效应,与下面三个方面有关：①改变周期细胞分布,G2/M期细胞比例增加；②抑制Ku70,减少CNE-1细胞DNA损伤后的再修复；③提高促凋亡因子Bad的表达，促进细胞的凋亡。

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实验材料与方法

实验结果

讨 论

结论及展望

参考文献

综述 P13K／Akt 信号转导通路与肿瘤细胞放射敏感性

攻读硕士学位期间发表论文以及参与课题

致 谢