青蒿DXS基因家族功能分化及低温促进青蒿素合成的分子机制研究

摘要

疟疾是一种严重危害人类健康的传染病，估计全球每年约4亿人感染，接近100万人因此而死亡。青蒿(Artemisia annua L.)是一种中国传统中药，因其含有可用于疟疾治疗的过氧桥键倍半萜内酯化合物青蒿素而闻名。然而在青蒿植株中青蒿素的含量极低，仅为干重的0.01-0.8％。植物次生代谢工程是提高青蒿素含量的有效策略之一。因此，解析青蒿素生物合成途径基因功能，尤其是对基因家族成员功能研究将加深对青蒿素生物合成机制的解析。
　　①青蒿DXS基因家族的克隆与分析
　　青蒿素是一种倍半萜化合物，其碳骨架 IPP和 DMAPP来源于定位于胞质的MVA途径及定位于质体的MEP途径。近年来报道MEP途径提供1分子的IPP构成FPP的核心骨架，因此MEP途径可能是青蒿素合成启动的关键。DXS是MEP途径的第一个关键酶，以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为底物催化合成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸。在拟南芥、玉米等植物中，DXS是个小基因家族由2-4个成员组成。然而遗憾的是，目前尚未见青蒿DXS基因家族成员功能研究的报道。本研究采用RACE技术从青蒿中获得了4条编码DXS的基因序列。氨基酸序列比对发现AaDXS4与其他3个DXS具有较大差异，缺少结合GAP和TPP的保守氨基酸位点。系统进化树结果显示所有DXS基因家族成员聚类为3枝，其中AaDXS1属于DXS1 clade，AaDXS2和AaDXS3属于DXS2 clade，而AaDXS4属于DXS3 clade，而其中DXS2 clade中DXS通常与植物次生代谢合成相关。构建亚细胞定位载体转化烟草原生质体，激光共聚焦结果显示所有AaDXS全都定位于质体，这与MEP途径基因编码蛋白在植物质体中表达的事实是吻合的。
　　②筛选稳定的内参基因为DXS基因家族表达模式研究奠定了基础
　　近年来荧光定量PCR因其具有高度灵敏性和特异性而成为基因表达模式分析的主流技术。在本研究中，qPCR用于分析 AaDXS家族基因在不同组织或不同处理植株中表达水平差异。然而内参基因的选择和验证对于使用qPCR进行基因表达研究是必要的前提。遗憾的是目前尚未对青蒿内参基因的稳定性进行评估。为了选择青蒿中适合用于qPCR分析基因表达的稳定内参基因，我们克隆10个看家基因18S rRNA,ACT,CYP,EF1α,GAPDH,RPⅡ,RPL13D,TUA,TUB和UBQ，并且考察它们在青蒿不同组织、低温胁迫、热休克、MeJA处理和ABA处理样本中的表达稳定性。采用两个基于Excel开发工具geNorm和NormFinder进行了稳定性分析。为了验证候选内参基因的稳定性，比较了不同组织样本中使用不同内参基因标准化的ADS基因表达水平，以及MeJA处理样本中使用不同内参基因标准化的ADS，CYP71AV1和DBR2的表达水平。
　　本研究的结果显示在10个候选内参基因稳定性表现多样，暗示单个内参基因不能同时适用于青蒿中所有样本。通过geNorm和NormFinder的分析，不同组织中RPⅡ&EF1α组合是稳定的内参基因。在植物激素处理的样本中，EF1α&TUB推荐作为内参基因用于分析目的基因的表达水平。此外，ACT&EF1α是最适合用于分析温度处理样本标准化的稳定内参基因组合。然而，应用广泛的内参基因如18S rRNA和CYP表现出较差的稳定性，并不适合作为内参基因用于分析青蒿中基因表达水平研究。为了进一步验证上述实验结果的可靠性，RPⅡ&EF1α组合用作内参基因分析ADS基因在不同组织中的表达水平，同时EF1α&TUB组合用于分析MeJA处理青蒿中ADS、CYP71AV1和DBR2基因的表达水平。验证实验显示在不同组织中EF1αand RPⅡ较18S rRNA更为稳定，CYP是不适合用作内参基因分析MeJA处理植株中基因表达水平。我们的结果将有助于分析在不同实验条件下青蒿中的基因表达水平。
　　③青蒿DXS基因家族成员的组织表达模式和诱导表达模式分析
　　基因家族成员的组织表达模式和诱导表达模式在一定程度上能够解释生物学功能上的差异。在筛选获得稳定内参基因的基础上，我们采用qPCR分析了青蒿不同组织，不同叶片中DXS家族基因的组织表达模式；同时利用MeJA、光诱导、机械伤害、盐胁迫和低温胁迫处理青蒿，分析DXS家族基因的非生物诱导表达模式。结果显示AaDXS3在花中的表达量最高，同时在不同叶片中AaDXS3在顶芽中的表达水平很高，而在老叶中表达水平较低，这与ADS基因的组织表达模式是一致的，暗示AaDXS3的表达水平可能与腺毛体的密度相关。在MeJA处理的青蒿中AaDXS2和AaDXS3均能够受到诱导，其中AaDXS3受诱导的表达水平更为强烈；AaDXS3能够快速响应光，这一表达模式与青蒿素生物合成途径关键酶基因ADS和CYP71AV1的表达模式相一致；AaDXS1是唯一能够受到机械伤害后表达上调的基因，而AaDXS3在此处理中表达水平显著下降。AaDXS2和AaDXS3能够响应盐胁迫且表达水平提高，低温胁迫早期所有成员表达水平均降低，而在6h后AaDXS2和AaDXS3的表达水平较对照有显著提高。
　　为了进一步研究AaDXS3的组织表达定位，采用FPNI-PCR方法获得AaDXS2和AaDXS3的启动子区域序列。plantCARE分析显示pAaDXS2存在响应光信号、MeJA等激素和冷胁迫的顺式作用元件；而pAaDXS3存在响应光信号、MeJA等激素的元件外，同时还有MYB、bZIP和WRKY等转录因子的结合位点；在转基因植株中组织化学染色发现pAaDXS3启动GUS在拟南芥腺毛体中表达。由于青蒿素的合成就是在青蒿叶片的分泌型腺毛体，因此AaDXS3的生物学功能很可能是为青蒿素等次生代谢产物提供前体IPP和DMAPP。
　　④低温胁迫诱导AaDXS3表达水平提高及青蒿素含量积累的分子机制
　　低温是一种有害的非生物胁迫，通常会导致植物中次生代谢产物的含量的增加以增强抗冻性。之前有报道称隔夜霜冻能够有效促进青蒿中青蒿素含量的增加。然而目前其分子机制尚不清楚。为了更好地理解低温胁迫如何促进青蒿素合成，我们考察了外源喷施 MeJA对青蒿抗冻性的影响。在低温胁迫时间进程中分析了內源JA、青蒿素及其相关代谢产物的含量，同时考察了JA生物合成途径基因、调控青蒿素生物合成相关转录因子和青蒿素生物合成基因的表达。我们发现外源茉莉酸有效地增强了青蒿幼苗的抗冻性。低温胁迫能够诱导JA生物合成基因LOX1,LOX2,AOC和JAR1基因的表达，从而导致了低温胁迫青蒿植株中內源JA水平提高。增加的内源性JA促进了三个响应JA信号相关的转录因子ERF1,ERF2,和ORA。上述三个转录因子均能激活青蒿素生物合成基因如ADS,CYP71AV1,DBR2和ALDH1表达。事实上，这四个青蒿生物合成相关基因在低温胁迫植株中的表达水平较对照显著地提高。随后，青蒿素和相关代谢产物如二氢青蒿酸、青蒿素B和青蒿酸的含量在低温胁迫青蒿中均得到提高。我们的研究为低温胁迫调控青蒿素产量的分子机制提供了解释。

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缩略词表

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1 绪论

1.1青蒿素的生物合成途径

1.2提高青蒿素含量的主要策略

1.3 MEP途径第一个关键酶DXS的研究进展

1.4课题的研究目的意义、研究内容及技术路线

2 青蒿DXS基因家族克隆与分析

2.1 引言

2.2材料、试剂与设备

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

2.6 本章小结

3 青蒿稳定内参基因的筛选与验证

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

3.6 本章小结

4 青蒿DXS基因家族表达模式分析

4.1 引言

4.2材料、设备与试剂

4.3实验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

4.6 本章小结

5低温胁迫促进青蒿素合成的分子机制

5.1 引言

5.2材料、试剂与设备

5.3 实验方法

5.4 结果与分析

5.5 讨论

5.6 本章小结

6结论与展望

6.1主要结论

6.2展望

致谢

参考文献

附录

A.作者在攻读学位期间研究的其他工作

B. 作者攻读学位期间发表的论文目录 (2010-2016)

C. 作者攻读学位期间主持和参加科研项目情况