基于代谢组学的肾盂肾炎尿液代谢表型谱研究

摘要

群体性尿路感染是由致病细菌感染尿道引发的泌尿系疾病。当致病细菌感染上行继而引发肾盂肾炎，宿主人体代谢反馈模式的改变以及相应的免疫清除过程被激活，分子表型上呈现病人尿液中系列小分子代谢物和关联代谢通路谱发生继发性修饰和偏离。因此，有效构建肾盂肾炎发生发展的特征性代谢表型谱，将有助于我们从代谢维度认识肾盂肾炎的发病机理，从修饰小分子的量变角度支撑其治疗和药物新靶点的发现。本研究基于核磁共振(NMR)和液质联用(LC/QTOF MS, LC/TQ MS)整合平台开发建立非靶向和靶向相结合的代谢组分析方法，进行肾盂肾炎患者和相应健康人群的比较尿液代谢表型谱研究，一方面，通过突变和修饰小分子代谢物的鉴定和定量表征，识别具有临床诊断价值的候选代谢标记物，以支撑肾盂肾炎的临床早期预警和诊断；另一方面，将所鉴定的突变和修饰的小分子代谢物进行生物信息学分析和代谢通路归属重构，从靶向代谢通路活性的修饰变化角度理解肾盂肾炎发生发展的代谢机理。
　　严格根据临床诊断和临床生物样品的采集规范，收集伴发血尿肾盂肾炎患者的中断尿液样品，同时依照病人对应的生理参数招募健康志愿者，并收集其中断尿液样品。代谢组学方法开发过程中在线全程优化样品制备、仪器分析参数和模式识别方法和参数，特征代谢通路构建的方法与模式，和生物信息学支撑的功能关联与分析方法，成功开发建立高效稳定的尿液代谢组学分析方法，应用于肾盂肾炎的代谢表型组研究。通过三种分析平台的整合应用，获得尿液代谢组学的原始谱图数据，首先利用相关生物信息学软件对谱图数据进行基线校准、归一化、去卷积和判别式分析，获得代谢组原始数据的三维矩阵。进一步采用Heatmap、非监督的主成分分析法(Pincipal Component Analysis, PCA)和监督型偏最小二乘判别分析法(Partial Least Squre-Discriminate Analysis, PLS-DA)，对尿液代谢组数据矩阵进行区组判别分析，可视化健康人群与肾盂肾炎病人群体尿液代谢表型组的差异。参考PLS-DA的VIP-plot（VIP>1）并整合相关数据库检索和靶向分析鉴别突变修饰代谢产物，本研究结果显示肾盂肾炎病人群体与健康人群的尿液代谢表型组显著区分，结合上述VIP判别原则，共发现和鉴定显著贡献尿液表型组区分的43个突变修饰代谢物。这些代谢产物主要集中于糖类物质及其代谢中间体，氨基酸类、核苷酸类和免疫相关反应物质。通过生物信息学检索和文献筛查辨识21个具有直接的生物学意义相关性的内源性化合物。糖类代谢物：葡萄糖（glucose）、UDP-葡萄糖醛酸酯（UDP-glucuronate）、L-谷氨酸盐（L-glutamate）、异丁酸盐（Isobutyrate）以及中间体4-羟基丁醇（4-hydroxybuty）、烟酸（ Nicotinic acid）、硫辛酰胺（lipoamide）；氨基酸类：酵母氨酸（Saccharopine）、赖氨酸（Lysine）、酪氨酸（Tyrosine）、甲硫氨酸（Methionine）、半胱氨酸（Cysteine）、天冬氨酸（Aspartate）、精氨酸（Arginine）、脯氨酸（proline）、腐胺（putrescine）、吡哆醛（pyridoxal）和色氨酸（Tryptophan）；免疫以及核酸类代谢物：前列腺素E（PGE）、胞嘧啶（Cytosine）、组胺（Histamine）。通过对这些化合物代谢通路的归属和构建以及生物信息学分析，发现这些代谢物的修饰变化和通路活性改变能够从不同角度阐释肾盂肾炎发生发展的特征代谢表型和代谢机理。这些结果的获得将为研究肾盂肾炎发病机制、临床诊断和治疗提供实践基础。
　　综上所述，本研究成功开发建立基于NMR和LC/MS的非靶向和靶向整合型尿液代谢组分析方法，成功应用于肾盂肾炎患者群体性代谢表型组研究。发现与表征突变修饰的代谢产物，回归构建其代谢通路，结合生物信息学挖掘，帮助我们从代谢角度认识肾盂肾炎的发病机理，为其临床诊断和治疗提供全新的代谢靶点和靶点群。

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缩略词对照表

1 文献综述

1.1肾盂肾炎研究简况

1.2肾盂肾炎发病机理与治疗研究进展

1.2.1细菌诱发肾盂肾炎的病源机制

1.2.2宿主与微生物相互作用机制

1.3代谢组学方法研究

1.4代谢组学的临床实践应用

1.5 本课题的立题思想和主要研究内容

2 整合型代谢组学方法的优化建立

2.1 样品预处理和代谢组学分析方法的优化开发

2.1.1 志愿者招募和尿液样品的规范采集

2.1.2 基于NMR的非靶向尿液代谢组学分析方法的优化建立

2.1.3基于LC/QTOF MS的非靶向尿液代谢组学分析方法的优化建立

2.1.4基于LC/TQ的非靶向尿液代谢组学分析方法的优化建立

3 肾盂肾炎尿液代谢表型组研究

3.1 基于NMR的肾盂肾炎非靶向尿液代谢表型组研究

3.1.1 NMR技术实验材料与主要仪器

3.1.2 NMR技术实验方法开发优化

3.1.3 NMR技术实验结果分析

3.1.4小结

3.2 基于LC/QTOF 的肾盂肾炎非靶向尿液代谢表型组研究

3.2.1 LC/QTOF MS技术实验材料与主要仪器

3.2.2 LC/QTOF MS技术实验方法开发优化

3.2.3 LC/QTOF MS差异性化合物生物学意义分析与讨论

3.2.4基于LC/QTOF MS技术的肾盂肾炎尿液代谢组学研究小结

3.3 基于三重四级杆LC/MS技术的肾盂肾炎尿液代谢组学研究

3.3.1 LC/TQ MS技术实验材料与主要仪器

3.3.2 LC/TQ MS技术实验方法开发优化

3.3.3 LC/TQ MS差异性化合物分析与讨论

3.3.4基于LC/TQ MS技术的肾盂肾炎尿液代谢组学研究小结

4 结 论

4.1 多元代谢组学分析方法的优化建立

4.1.1 NMR生物样本的制备和数据采集优化方

4.1.2 LC/QTOF MS生物样本的制备和数据采集优化方法

4.1.3 LC/TQ MS生物样本的制备和数据采集优化方法

4.2肾盂肾炎发生发展修饰的特征代谢组的生物学意义

4.2.1糖类代谢物和糖代谢中间产物的生物学意义

4.2.2氨基酸类代谢物的生物学意义

4.2.3免疫反应相关代谢物的生物学意义

致谢

参考文献