应用基因芯片技术筛选先天性巨结肠相关基因的研究

摘要

研究目的：
　　本研究旨在应用基因芯片技术筛选先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HD）病变组织与自身正常组织之间的差异表达基因，为先天性巨结肠相关基因进一步功能研究以及进一步探讨其在先天性巨结肠发生发展过程中的作用及机制打下基础。
　　研究方法：
　　在2011-01至2012-01期间，收集广州医学院附属广东省妇女儿童医院外科手术经病理证实的10份先天性巨结肠病变组织和病变切缘对应正常组织标本。本研究采用Agilent公司包含3.5万个基因的全人类基因组表达谱芯片，检测4对先天性巨结肠及其正常切缘组织的基因表达谱，按照至少在4个样本中信号值大于800为表达有意义，筛选出有表达的基因。应用芯片差异显著性分析(significance analysis of microarray,SAM)软件对有表达的基因进行差异表达分析，初步筛选获得先天性巨结肠差异表达基因；对差异表达基因进行生物信息学分析，根据 Gene ontology(GO)分类体系初步对得出的差异表达基因进行功能分类,对其功能进行初步分析。
　　最后采用RT-PCR技术对个别差异表达基因进行验证。
　　研究结果：
　　按照至少在4个样本中信号值大于800为表达有意义，筛选出有表达意义的基因12125个。应用芯片差异显著性分析(significance analysis of microarray,SAM)软件,按差异倍数值≥2.0倍或≤0.5倍为差异显著性标准，对有表达的基因进行差异表达分析，筛选4对标本的差异表达基因共622个，其中下调基因有584个（93.89％），上调基因38个（6.11%），通过聚类分析表明，上述这些差异表达的基因能够很明显的区分HD病变组织和正常组织。在前10位极显著上调和下调的差异表达基因（即共20条）中，查阅文献，发现均没有在HD或HD相关疾病中报道过。将这些差异表达基因按 Go(gene ontology)分子功能(Molecular Function)进行分类，发现这些差异表达基因与细胞粘附,肌肉发育，细胞与基质之间的连接装配,钙离子的转运,神经系统发育,细胞骨架,神经轴突引导,神经胶质细胞发育等有关。
　　RT-PCR技术验证6条差异表达基因，显示其结果与基因芯片检测结果一致，验证了基因芯片数据的准确性。
　　结论
　　基因芯片是一高效、可靠筛选先天性巨结肠差异表达基因的方法，本研究通过对基因芯片的有效应用，发现先天性巨结肠组织与正常结肠组织间在基因的表达层面存在明显差异,筛选得到的基因可能与先天性巨结肠的发生发展密切相关，可能在HD病变发生发展过程中具有重要生物学功能；，对相关的差异表达基因需要进行更深入的分子水平的研究，探讨其在 HD病变发生发展过程中的可能作用机制。对于筛选得到的大量基因信息而言，为感兴趣的生物学过程设定一个限制，在有限的范围内比较相关基因的功能、细胞定位及其表达水平的高低，将有利于发现其中功能上有相互联系的基因，为选择出兴趣基因进行基因或蛋白水平的研究提供一定的线索。

目录

封面

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英文缩略词注解

中文摘要

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前言

实验技术路线图

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 本院病理科部分先天性巨结肠及切缘组织病理结果

2 标本RNA质检结果

3 基因芯片检测结果

4 RT-PCR验证结果：

讨论

1.筛选到的差异表达基因

2.展望

结论

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢

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