水通道蛋白3在小鼠早期胚胎发育过程中的表达及在玻璃化冻融过程中的作用

摘要

研究背景：
　　水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一类介导高效水转运的膜蛋白，广泛分布于机体组织细胞的胞膜上，介导各种类型细胞膜的水转运,在维持细胞的渗透压平衡中发挥重要的作用。迄今为止，研究发现的哺乳动物水通道家族已有13个成员(AQP0-AQP12)，根据其功能主要分为专一性水通道蛋白及甘油水通道蛋白两大类。甘油水通道蛋白比较特殊，它们不仅可以介导自由水跨膜转运，还可介导一些线性小分子物质如甘油、尿素、羟基化合物等的转运，包括AQP3，7，8，9和AQP10。近十年来，AQPs的结构及功能被各学科所关注。有文献报道，有11种水通道蛋白（AQP0-AQP10）丰富地表达于哺乳动物的睾丸、精子、卵泡、子宫、胚胎、胎盘、胎膜等组织，参与精子发生、卵泡发育成熟、囊胚形成、胚胎着床、母胎液体平衡等生殖过程。AQPs表达于小鼠早期胚胎已多次得到证实，其中，AQP3 mRNA、AQP7mRNA高表达于早期胚胎各发育时期、AQP8 mRNA高表达于早期囊胚是多项研究结果的一致之处，且各时期胚胎AQPs的表达情况可随环境的改变而发生变化。
　　自1983年Trounson等取得冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，F-ET）的临床妊娠以来，F-ET已经成为人类辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）的重要组成部分，据统计，全世界应用ART的出生儿中，有25％来自F-ET周期；在ART所有的移植胚胎中，约42%来自冻融胚胎。因此，胚胎冻融技术在 ART中占有重要地位，且随着近年来大力提倡单胚胎移植，如何进一步完善胚胎冻融的方法，保障冻融胚胎的复苏率及质量也成为学术界研究的热点。
　　有研究指出，细胞的膜渗透性是决定其能否耐受冷冻过程的关键因素，冻融成功的关键在于水和高浓度低温防护剂在细胞内外的快速跨膜转运、分布并达到渗透压平衡。还有研究表明，早期胚胎在高渗溶液中起应激反应的主要效应之一是AQPs的表达及蛋白定位的变化，且目前除了AQPs外尚未发现其他可介导水分子跨膜转运的物质。那么，AQPs在早期胚胎中的表达特性如何？其如何参与早期胚胎的发育过程？在哺乳动物早期胚胎的冻融过程中，AQPs特别是甘油水通道蛋白亚族是否就是水和低温防护剂跨膜转运分布的主要分子途径？如果是，其作用机制如何？这些问题至今并未得以完全阐明。
　　本研究选取在早期胚胎各阶段均有高表达且可能在高渗冷冻防护剂环境中发挥作用的AQP3，研究其在小鼠早期胚胎各发育时期的表达规律与分布特征，并通过对比胚胎玻璃化冷冻-解冻前后AQP3表达情况的变化，探讨AQP3在小鼠早期胚胎发育过程中的作用及在胚胎冻融过程中的可能调节机制。本研究对完善生殖生理学中早期胚胎发育的机制、阐明胚胎冻融过程中膜调节机制具有重要意义，也是发展胚胎冻融改进方法的重要切入点。
　　研究内容：
　　第一部分：AQP3在小鼠早期胚胎发育过程中的表达及作用
　　目的：
　　检测小鼠早期胚胎各发育时期AQP3的表达及分布情况，探讨AQP3在小鼠早期胚胎发育过程中的作用及机制。
　　材料与方法：
　　对实验小鼠予孕马血清促性腺激素（PMSG）联合绒毛膜促性腺激素（HCG）制备控制性超促排卵（COH）模型，使其交配受孕；手术法收集不同发育时期的早期胚胎：四细胞期（HCG注射后60小时）、八细胞期（HCG注射后65-68小时）、桑葚胚期（HCG注射后72-80小时）、早期囊胚（82-90小时）。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测四个时期的胚胎AQP3 mRNA的相对表达量，采用2-△CT法计算各时期胚胎AQP3 mRNA的相对表达量并进行比较，采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，P＜0.05认为差异有统计学意义；免疫荧光显微镜对收集到的各时期胚胎进行AQP3表达的定性检测；激光共聚焦显微镜对各时期胚胎进行AQP3蛋白亚细胞定位分析。
　　结果：
　　1.qRT-PCR结果显示，小鼠四细胞期、八细胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚均有AQP3 mRNA表达，其中桑葚胚期最高，囊胚期的表达最低，但各组间差异均无统计学意义（P>0.05）
　　2.免疫荧光显微镜检测结果显示，小鼠四细胞期、八细胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚均可检测到特异性AQP3的阳性信号，阴性对照未检测到荧光信号。
　　3.激光共聚焦显微镜扫描结果发现，四细胞期及八细胞期胚胎的特异性 AQP3荧光信号均分布在卵裂球的胞质、核膜处，其中均以核膜处的荧光信号较强；桑葚胚的AQP3荧光信号主要分布在各卵裂球的胞膜及各卵裂球连接处；早期囊胚则主要分布滋养层细胞的胞质及胞膜中，囊胚腔中也可见荧光信号。
　　结论：
　　1.AQP3 mRNA表达于小鼠早期胚胎各发育时期，提示AQP3 mRNA可能参与胚胎基因组的组成，对小鼠早期胚胎的发育起潜在的调控作用。
　　2.AQP3的蛋白亚细胞定位在各发育时期不完全相同，说明其可随各时期胚胎的发育需要而发生表达和功能上相应调节。
　　第二部分：水通道蛋白3在小鼠胚胎玻璃化冷冻前后的表达及分布变化
　　目的：
　　比较AQP3在小鼠八细胞期胚胎、桑葚胚及早期囊胚玻璃化冻融前后的表达及分布情况，以探讨AQP3在小鼠早期胚胎冻融过程中的可能作用及调节机制。
　　材料与方法：
　　制备小鼠 COH模型，显微镜下手术法收集小鼠八细胞期、桑葚期胚胎及早期囊胚（方法同第一部分）。应用免疫荧光显微镜、激光共聚焦显微镜技术、蛋白印记法（Western Blot）检测以上三个时期新鲜胚胎AQP3的表达、分布情况及蛋白相对表达量；对这三个时期的胚胎进行玻璃化冷冻-解冻，应用免疫荧光、激光共聚焦显微镜技术及Western Blot对冻融后三个时期的胚胎AQP3的表达、分布情况及蛋白相对表达量进行检测，并与同时期新鲜胚胎进行对比分析。重复实验3次。Western Blot以GAPDH条带为内参进行蛋白上样量校正，条带采用Image Plus6.0专业图像分析软件进行分析，取平均值进行计算，采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.免疫荧光显微镜检测结果显示，在冷冻前、冻融后的各时期胚胎均可检测到明显的特异性AQP3的阳性、信号，阴性对照未检测到荧光信号。
　　2.激光共聚焦扫描结果发现，新鲜胚胎：八细胞期胚胎的绿色荧光均质分布在卵裂球的核膜、胞质处，其中核膜处荧光信号较强；桑葚胚的绿色荧光较均质分布在各卵裂球的胞膜；早期囊胚主要分布在滋养层细胞的胞质、胞膜中，囊胚腔内也可见荧光信号。冻融复苏后胚胎：八细胞期胚胎的绿色荧光呈明显小颗粒状分布于卵裂球的胞膜、胞质，少数分布于核膜处；桑葚胚主要分布于胞膜；早期囊胚主要分布于滋养层细胞的胞膜、胞质中。
　　3.Western Blot检测到各组胚胎冻融前后均有AQP3表达，以校正值K（AQP3条带IOD/GAPDH条带IOD）进行半定量分析，统计分析结果显示：胚胎冷冻前，八细胞期AQP3相对表达量最高，其次为早期囊胚，桑葚胚期最低，组间差异有统计学意义（P<0.05）；胚胎冻融后，桑葚胚期 AQP3相对表达量最高，其次为八细胞期，早期囊胚期最低，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。八细胞期及早期囊胚冻融后AQP3相对表达量均显著低于冷冻前（P<0.05），而桑葚胚期则高于冷冻前（P<0.05）。
　　结论：
　　1.AQP3在KM小鼠新鲜胚胎的蛋白亚细胞定可位随各发育时期的不同而显示不同的表达模式，而经过玻璃化冷冻-解冻，各时期复苏胚胎的AQP3蛋白定位都主要位于胞膜上，提示 AQP3可能在小鼠早期胚胎各时期的冻融过程中均主要介导胚胎与外界的液体交换，发挥积极的调节作用。
　　2.在桑葚胚期，相对于冷冻前，冻融后胚胎的AQP3蛋白相对表达量显著升高，提示在此时期胚胎的冻融过程中，AQP3可能发挥液体交换的主导作用。此外，我们推测在八细胞期及桑椹期胚胎，可能有其他亚型的AQP发挥主导液体转运的作用。

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缩略词表

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前 言

第一部分 水通道蛋白3在小鼠早期胚胎发育过程中的表达及作用

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 小结

第二部分 水通道蛋白3在小鼠胚胎玻璃化冷冻前后的表达及分布变化

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

结 论

参考文献

综述

附 录

致谢

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