甘露糖用于细菌选择性识别及其相互作用研究

摘要

糖分子可与细菌表面的凝集素发生选择性识别，探究其与细菌之间的相互作用，对糖类分子用于细菌识别等研究具有重要的意义，也是目前糖生物学研究领域的热点之一。将无毒且价格低廉的糖分子与纳米粒子结合得到糖纳米探针，结合了纳米粒子大的比表面积和良好的光电特性和糖分子水溶性和生物相容性好的优势，可更好的应用于糖与细菌相互作用、糖与细菌识别及其糖用于细菌定量检测等研究。据此，本文提出将可与表达I型菌毛细菌选择性识别的甘露糖为研究对象，结合纳米探针独特的优势，制备得到糖纳米探针，实现甘露糖与细菌亲和作用的研究，进一步结合微流控芯片技术和方法，以甘露糖为识别元件，实现对表达I型菌毛细菌的在线识别和捕获。相关研究在糖与细菌选择性识别及其相互作用研究中具有明确的研究意义，对抑制细菌粘附细胞的糖分子骨架筛选等有着非常好的应用前景。
　　本文的主要研究工作及结果如下：
　　1.基于Man-CQDs的甘露糖与细菌相互作用研究
　　利用柠檬酸为碳源制备得到了表面含有丰富羧基的荧光CQDs，将氨基修饰的甘露糖以共价键的方式固定在CQDs表面制备得到Man-CQDs，结合Scatchard模型方程，计算并分析了甘露糖与细菌的结合常数，建立了两者之间的亲和作用研究的新方法。以大肠杆菌和沙门氏菌作为研究对象，结果显示Man-CQDs与沙门氏菌S.123443和大肠杆菌JM109都具有较强的亲和作用，结合常数分别为1.17×105L·moL-1、2.39×103L·moL-1，与大肠杆菌DH5α无有效结合。建立的新方法，可计算得到糖与细菌的结合常数，为糖与细菌相互作用研究提供理论支撑。
　　2.基于Man-Fe3O4和Man-CQDs纳米探针双标记模式的甘露糖与沙门氏菌选择性识别研究
　　以甘露糖为沙门氏菌S.123443识别元件，结合磁性纳米粒子和荧光纳米粒子，制备得到了糖纳米探针，采用Man-Fe3O4和Man-CQDs纳米探针双标记模式，实现沙门氏菌的选择性识别。将Man-Fe3O4纳米探针加入混合菌液中，进行选择性识别和捕获沙门氏菌，进一步加入Man-CQDs纳米探针，实现对被捕获沙门氏菌的荧光标记，采用荧光光谱仪对标记的沙门氏菌进行荧光信号测试。结果显示，Man-Fe3O4和Man-CQDs纳米探针对沙门氏菌能够选择性识别，且Man-CQDs纳米探针能够高效地对沙门氏菌进行荧光标记。沙门氏菌浓度的对数与相应荧光值存在良好的线性关系，线性方程为IFL=217.2Log(c)-758.8(R2=0.9578)，线性范围为104-107cfu·mL-1，检测限为5×103cfu·mL-1。糖分子本身无毒且价格低廉，是较为理想的细菌识别元件，进一步采用磁性和荧光纳米探针双标记的模式，能够实现细菌选择性捕获和荧光标记，对进一步研究糖与细菌相互作用做铺垫。
　　3.基于微流控芯片的甘露糖与细菌选择性识别研究
　　设计了集成6条通道的PDMS-Glass微流控细菌芯片，并搭建小型荧光微系统以及相应的细菌芯片检测微系统，实现了对表达I型菌毛的细菌的选择性识别和捕获，建立了细菌选择性识别捕获的微流控芯片检测系统。在芯片通道底层共价修饰了甘露糖分子，同时以荧光量子产率高的吖啶橙为标记试剂，对五种细菌进行荧光标记，在芯片上成功地实现了对沙门氏菌S.123443、大肠杆菌W1485和大肠杆菌JM109三种细菌的选择性识别和捕获，捕获效率分别为57.25%、43.69%、40.97%，大肠杆菌DH5α和金黄色葡萄球菌不能被选择性识别和捕获。主要是因为沙门氏菌S.123443、大肠杆菌W1485和大肠杆菌JM109三种细菌的菌毛末端有甘露糖的识别位点，而大肠杆菌DH5α和金黄色葡萄球不具有该识别位点，这与甘露糖能与表达I型菌毛的细菌选择性识别的理论相符合。该方法实现了对表达I型菌毛的细菌的识别和捕获，避免在多条通道中修饰多种的细菌识别元件的繁琐操作，具有快速、灵敏且操作简单的优点，为糖用于细菌选择性识别研究提供了一个新的平台。

目录

1 绪 论

1.1 引言

1.2 糖与细菌识别的国内外研究现状及发展动态

1.3 糖与细菌相互作用研究

1.4 基于纳米标记的细菌检测研究进展

1.5 微流控芯片用于细菌检测的研究进展

1.6 研究意义及主要研究内容

2 基于Man-CQDs的甘露糖与细菌之间的相互作用研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 小结

3 基于Man-Fe3O4和Man-CQDs纳米探针双标记模式的甘露糖与沙门氏菌选择性识别研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 实验结果与讨论

3.4 小结

4 基于微流控芯片的甘露糖与细菌选择性识别研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 小结

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附录

A.作者在攻读学位期间发表的论文目录

B.作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目