红景天苷诱导高糖环境下骨骼肌细胞分泌功能促进下肢血管再生的研究

摘要

糖尿病是全球性的健康问题。世界许多地区糖尿病患病率稳步上升，预计随着肥胖和其他糖尿病临床的危险因素的增加，糖尿病的患病率将继续上升。糖尿病的血管并发症是该疾病最严重的临床表现之一。糖尿病是外周动脉疾病的主要危险因素,会导致发病率和死亡率增加以及疾病进程的加快。临界肢体缺血（CLI）是外周动脉疾病的晚期阶段。糖尿病会使关键性肢体缺血的发生率和严重程度增加两倍。糖尿病也是CLI术后截肢和并发症的单一危险因素。CLI通常是由于向下肢供血的动脉受到阻碍造成的，最终导致一系列的腿部的静止疼痛或营养性损伤的病理生理事件。我们身体对缺血的第一反应是诱导血管生成;然而，由于参与血管发生的细胞如内源性细胞，平滑肌细胞和巨噬细胞等的细胞功能障碍，这种内源性潜力在高糖环境下被破坏。因此，随着血糖的升高和糖尿病持续时间的的增长，糖尿病患者的下肢缺血程度会越来越严重。
　　目前的实践表明，通过使用外科手术来进行动脉重建，其具有至少75％的1年无截肢生存率，作为治疗CLI的首选。然而，许多患者，特别是具有大的表面损伤和高度再发生的患者，如糖尿病患者，已被认为在外科手术方面“无选择”。旨在诱导产生新血管的治疗性血管生成被认为是CLI的最有潜力的治疗方法。因为CLI的特点是在肌肉和上皮组织中经过了数周或数月的长期缺氧，所以促进局部血管生成可在临床治疗上有所帮助，包括缓解疼痛，局部缺血性溃疡的愈合以及主要肢体截肢的发生率的降低。在过去二十年中，已经尝试通过使用重组蛋白，遗传方法和干细胞诱导治疗性血管生成。然而，目前在糖尿病中没有针对CLI的有效的基于药物的治疗方法。
　　骨骼肌是人体最大的分泌器官，可以分泌许多的旁分泌和自分泌信号，包括血管生成因子。我们前期的研究表明，骨骼肌细胞可以同时分泌一些旁分泌信号，包括血管生成因子，这又可以增强骨骼肌细胞与参与血管发生的细胞如内皮细胞和平滑肌细胞之间的细胞间通讯。这些旁分泌信号影响参与血管生成的细胞的生物学功能，并且随后促进新生血管形成。然而，高血糖会破坏骨骼肌细胞的分泌功能，因此增强骨骼肌细胞的这种生物功能已经成为糖尿病患者新生血管形成的亟待解决的问题。
　　在过去的几十年中发现，在治疗糖尿病及其并发症方面，传统的中医药比现有的药物疗效更显著且副作用更少。在本研究中，我们使用红景天苷来促进糖尿病患者的新生血管形成。红景天苷是红景天的主要化合物，红景天是一种在高海拔山区发现的药用植物。红景天本身已被广泛应用于传统医学，由于其适应性和抗疲劳性能。红景天苷显示广泛的药理学性质，如抵抗缺氧症，抗疲劳，抗氧化和增强细胞存活。然而，糖尿病患者是否可以诱导新生血管形成仍未知。
　　我们发现，在高血糖状态下，血管生成因子如血管内皮生长因子（VEGF）和血小板衍生生长因子（PDGF-BB）在骨骼肌细胞的表达水平显着降低。各种研究表明VEGF和PDGF-BB的表达在局部缺血的侧支血管的形成中至关重要。另一方面，高血糖诱导脯氨酰羟化酶结构域3（PHD3）的表达，脯氨酸羟化酶结构域家族已被认为能增强骨骼肌细胞中血管生成因子主要调控因子缺氧诱导因子（HIF-1α)的表达。骨骼肌细胞沉默PHD3使由高血糖病症抑制的VEGF和PDGF-BB的表达回升。因此，这些结果表明PHD3的上调可能是导致高血糖症血管生成因子下调的原因。我们还发现，加入红景天苷可使高血糖症中PHD3的上调回降，并伴随着骨骼肌细胞中的VEGF和 PDGF-BB表达的上调。此外，红景天苷还可以恢复由高血糖抑制的骨骼肌细胞的增殖和迁移潜力。
　　VEGF和PDGF-BB是影响内皮细胞和平滑肌细胞增殖和迁移的关键血管生成因子。结果表明，伴随着高血糖症骨骼肌细胞中这些因子的表达水平受到抑制，高血糖条件下培养的骨骼肌细胞获得的条件培养基培养的内皮细胞和平滑肌细胞的迁移和增殖潜力也受到影响。然而，当使用高糖条件下培养的经红景天苷处理的骨骼肌细胞获得的条件培养基时，这些潜力得以恢复，表明红景天苷诱导的骨骼肌细胞旁分泌信号足以影响高糖内皮和平滑肌细胞的生物学功能。此外，我们的研究结果表明，PHD3的过表达降低了红景天苷在高糖中诱导内皮和平滑肌细胞迁移和增殖的作用，表明红景天苷通过抑制PHD3对内皮和平滑肌细胞的生物学功能发挥作用。
　　最后，我们考查了糖尿病小鼠模型中红景天苷是否可以促进缺血组织的新生血管形成。我们的研究结果表明，红景天苷可以有效促进链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠缺血后肢血液恢复，最可靠的是通过抑制由高血糖诱导的骨骼肌细胞PHD3的表达水平，从而促进旁分泌信号，特别是骨骼肌细胞中VEGF和PDGF-BB。结果表明，红景天苷治疗可以提高高血糖抑制血管内皮细胞和平滑肌细胞的迁移和增殖能力，增强糖尿病小鼠缺血后肢的新生血管形成和血液恢复。
　　总之，我们的研究首次揭示了红景天苷在糖尿病CLI小鼠模型中诱导新血管形成的功效，最有可能是通过增强骨骼肌细胞的旁分泌功能。虽然需要进一步研究，比如红景天苷的副作用和更详细的临床前研究。我们的新发现表明，红景天苷可能是在糖尿病CLI治疗中诱导血管生成的潜在的小分子药物。

目录

ABBREVIATION

1 Background

1.1 Pathophysiology of Critical Limb Ischemia

1.2 Roles of Platelet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) and Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in angiogenesis

1.3 Role of Prolyl Hydroxylase in angiogenesis

1.4 Salidroside

1.5 Study Purpose and Innovation

1.6 Study Plan

2 Effect of salidroside on promoting angiogenic factors in skeletal muscle cells in high glucose condition

2.1 Materials

2.2 Method

2.3 Results

2.4 Discussion and Conclusion

3 Effect of salidroside on skeletal muscle cell mobility and proliferation in high glucose condition

3.1 Materials

3.2 Method

3.3 Results

3.4 Discussion and Conclusion

4 Overexpression PHD3 inhibited the effect of salidroside on promoting angiogenesis in high glucose condition

4.1 Materials

4.2 Method

4.3 Results

4.4 Discussion and Conclusion

5 Effect of conditioned medium of skeletal muscle cell secretome in human endothelial cell and smooth muscle cell mobility, distribution of filament actin and proliferation under high glucose condition

5.1 Material

5.2 Method

5.3 Results

5.4 Discussion and Conclusion

6 Conditioned medium of skeletal muscle cell that containing overexpression PHD3 inhibited the effect of salidroside on inducing human endothelial cell and smooth muscle cell mobility and paracrine function under high glucose condition

6.1 Materials

6.2 Method

6.3 Results

6.4 Discussion and Conclusion

7 Effect of salidroside on critical limb ischemia of streptozotocin-induced diabetic mice model

7.1 Materials

7.2 Method

7.3 Results

7.4 Discussion and Conclusion

8 Conclusion and Future Prospects

8.1 Conclusion

8.2 Future Prospects

致谢

参考文献